由澳大利亚悉尼麦考瑞大学领导的一组研究人员比较了各种商业试剂盒从患者血液样本中提取循环无细胞DNA (cfDNA)的能力。
研究小组发现，总的来说，基于旋柱的提取试剂盒——如Qiagen公司的QIAamp循环核酸试剂盒和Norgen公司的Biotek公司的血浆/血清细胞无循环DNA纯化midi试剂盒(NorS)——比最近推出的基于磁珠的试剂盒表现更好。
为了检测cfDNA，研究人员通常使用基于自旋柱或磁珠技术的工具。vwin德赢ac米兰合作虽然自旋柱比磁珠方法更昂贵，产生结果所需的时间更长，但它们通常在患者样本中产生更高的cfDNA回收率
在一项研究中发表在癌症遗传学上个月，研究人员检测了几种手动和自动旋转柱和磁珠的商业试剂盒，以检测健康患者血浆中插入的黑素瘤cfDNA。
麦格理大学高级研究员、第一作者Russell Diefenbach解释说:“我们最初的目标是提高循环肿瘤DNA (ctDNA)的回收率，研究了一些不同的参数，比如培养时间、改变洗脱量，或者是否重复洗脱。”“令人失望的是，这些参数并没有显著改变产量，因为我们还想提高对下游活动DNA检测的灵敏度或限制。”
在Diefenbach和他的团队展示了Qiagen (QiaS)在最大化ctDNA产量方面是多么的困难之后，他们决定将该试剂盒与其他公司开发的工具进行比较。研究人员首先在三到四毫升健康人类血液样本中加入每毫升500纳克从BRAF突变黑素瘤细胞系纯化的cfDNA。
Diefenbach说:“最初，我们增加了大量的cfDNA，因为我们想在更大范围或更广泛的DNA片段中捕捉信息。”“我们还决定使用健康患者的样本，因为我们不想在这种类型的分析中浪费宝贵的患者DNA。”
研究小组将来自澳大利亚黑素瘤研究所的血液样本，以及剩余的1毫升未添加的血液样本，通过商用cfDNA纯化试剂盒进行了检测。除了Qiagen公司和Norgen公司基于旋柱的试剂盒外，研究人员还使用了基于磁珠的试剂盒，包括Qiagen公司的QIAamp minElute ccfDNA微型试剂盒(QiaM)、Promega公司的Maxwell RSCS ccfDNA血浆试剂盒(ProM)、Applied Biosystem公司的MagMax cfDNA分离试剂盒(ABioM)和Bioo Scientific公司的nextpre - magg -cfDNA分离试剂盒(BSciM)。
Diefenbach说:“似乎每周都有一种提取ctDNA的新试剂盒。”因此，他的团队的目标是选择市场上基于磁性和旋转柱的套件的最佳代表。他指出:“这项(研究)并不是为了捕获所有的试剂盒，因为人们可能正在开发试剂盒，而是在可能的情况下将该领域标准化。”
对于插入血浆cfDNA实验，该团队首先使用QiaS试剂盒从黑素瘤细胞系M229中提取cfDNA。
然后，研究人员分析了长度从50个碱基对(bp)到800个bp的纯化尖插ctDNA。虽然Diefenbach估计正常ctDNA的长度约为130-170 bp，但他也指出，ctDNA的多个副本可以相互结合，形成更长的bp。然后，该小组使用液滴数字PCR系统检测非加刺野生型NRAS或加刺突变型BRAF。
Diefenbach说，随后，研究小组对更接近患者生理水平的细胞类型使用了少量的插入ctDNA。
研究小组发现，所有的纯化试剂盒都能回收不同数量的低分子量DNA片段，范围从50到766 bp。由于血液中的蛋白质“消化”，研究人员未能收集到25个bp的DNA片段，Diefenbach指出，他的团队设法回收了50个bp的片段，“尽管效率较低”。
研究人员发现，QiaS、NorS、QiaM、ProM和ABioM试剂盒在75-808 bp范围内具有一致的恢复水平。相比之下，他们发现BSciM试剂盒显示出最多变的恢复情况。
同时，研究人员指出，基于自旋柱的QiaS和NorS试剂盒在基于总DNA片段平均回收率的总体回收率上没有显着差异。此外，他们还发现这两种工具比磁珠工具显示出“明显更高的回收率”。
在基于磁性的试剂盒方面，研究人员发现，在提取肿瘤DNA片段和最小化细胞和其他小分子污染方面，QiaM的表现明显优于同类产品。
Diefenbach和他的同事们然后比较了QiaS试剂盒和QiaM试剂盒，基于他们使用插入DNA的总回收率。该小组分析了基于从健康血浆中提取携带BRAF体细胞突变的非加标cfDNA或加标cfDNA的工具。他们发现，与QiaS工具相比，QiaM试剂盒从5名健康患者的血浆中提取的平均DNA拷贝数显著下降。
总的来说，该研究的作者认为，目前可用的cfDNA提取试剂盒——无论所使用的技术类型如何——在提高cfDNA检测的灵敏度方面并没有“超过”QiaS试剂盒。vwin德赢ac米兰合作
Diefenbach解释说，虽然QiaS更昂贵和耗时，但该工具以自动化形式用于高通量使用(称为QIAcube)有助于将其与研究中其他基于旋转柱的试剂盒区分开来。
Diefenbach说:“我并不是说我们不应该使用NorS系统，而是说这取决于你的下游应用。”“如果你对高吞吐量感兴趣，QIAcube是一个更好的设置，而不是像NorS这样的手动工具包。”
然而，该团队也指出，如果研究人员使用替代的、更便宜、更省时的方法，如磁珠试剂盒，如QiaM试剂盒，他们只需要接受回收的ctDNA的总体产量可能低于预期。
为了使ProM试剂盒成为一种潜在的替代方案，该研究的作者认为，更大的样本，基于体积的选择需要像QiaS一样在收集非加标DNA时表现良好，并且只能“在自动化模式下可用”。
从比较研究中，研究人员将使用QiaS提取工具进行下游下一代测序技术，因为该分析具有多种癌症突变的能力。vwin德赢ac米兰合作Diefenbach说，他的团队有兴趣开发“定制的NGS和靶向热点面板”，这将在未来的功能研究中识别某些癌症生物标志物，以及理解为什么患者对免疫疗法有耐药性。
根据Diefenbach的说法，研究人员还可以应用提取工具来纯化血浆中循环的其他物种的DNA。
Qiagen公司样品技术主管Markus Sprenger-Haussels说，该公司的QIAamp试剂盒——每两毫升样品的价格为36.70澳元(26.04美元)——与其他公司的工具不同，是因为该公司在过去几年里开发出了多个“小差异”。这些变化包括“良好平衡的裂解化学，从其核小体复合物以及细胞外囊泡、外泌体和癌小体中释放循环的cfDNA。”
“如果你想从血浆中提取循环的cfDNA，最好使用你的血浆和真正的循环cfDNA，而不是使用人工测试系统，”Sprenger-Haussels说。“其他公司从制造人造血浆之类的材料开始，这种材料具有类似的蛋白质成分，但实际上，它的作用不同。你有很多背景材料可能会干扰样品准备，这将无法优化处理(样品)。”
Sprenger-Haussels指出，Qiagen公司目前正在与客户合作，他们希望每次提取使用10毫升或更多，这比标准的QIAamp工具需要更多的时间。因此，该公司开发了QIAamp minElute磁珠工具，该工具每次运行成本为18.66澳元，适用于更大容量的血液。
根据Sprenger-Haussels的说法，不同的研究人员对DNA bp长度的研究小组应该专注于检测患者血液中肿瘤的存在进行了争论。Sprenger-Haussels说，一些人声称肿瘤cfDNA非常小，如果血浆中DNA浓度较高，那么它来自肿瘤而不是DNA。然而，其他研究人员声称，对癌症感兴趣的DNA是分子量较高的部分。
Sprenger-Haussels说:“因此，Qiagen公司试图优化两组人的方案:一组人专注于小DNA，另一组人则寻求大DNA。”“我们不排除大的DNA，因为我们已经了解到，在这部分中可能存在有价值的肿瘤DNA，来自癌小体和循环肿瘤细胞的降解过程。”
Promega高级研究科学家道格拉斯·霍雷什(Douglas Horejsh)发现，研究人员最初在患者血浆中发现的裸DNA含量异常高。他解释说，cfDNA的内源性水平通常在每毫升5到25纳克左右，而不是在研究的第一部分进行的加标样品中每毫升500纳克。
Horejsh说:“当我们通常与研究人员或客户合作时，我们通常会敦促他们使用匹配的等离子体来比较不同平台之间的性能。”他认为，使用尖峰系统可能会导致“定义不清”的结果和不同的解释，这取决于研究人员试图用这些工具证明什么。
该公司的自动化ProM套件要求用户在将其插入机器之前，先将0.2到1.0毫升的等离子移液到墨盒中。该提取工具的成本为31.26美元，然后运行约一个小时，有效地纯化血浆样本。
然而，Horejsh承认，Promega正在研究Maxwell试剂盒，以提高提取的体积大小。此外，该公司计划在未来发布套件，以增加“其他更大的自动化平台”的体积。
“通常情况下，研究人员希望使用一管全血，它会产生4到5毫升血浆，”Horejsh说。“我们正在努力以一种简单易用的形式来满足这一需求。”
Norgen Biotek业务开发副总裁Nezar Rghei不理解研究人员决定选择QiaS作为ct-DNA提取的黄金标准的理由。
根据Rghei的说法，Norgen公司的自旋柱套件与Qiagen公司的不同之处在于它采用了不同类型的矩阵。与Qiagen的硅基色谱柱不同，NorS使用碳化硅来结合肿瘤核酸。和Horejsh一样，Rghei认为研究人员添加DNA的方式，“裸”和没有组蛋白的DNA，以及肿瘤DNA的数量并不能准确反映正常患者血液样本中存在的数量。
Rghei说:“在Qiagen工具上观察到更多的差异，将DNA浓度提高到正常水平将更有意义。”“当你插入样本时，DNA很快就会被酶降解……(较小的)条带可能已经被消化了，因为它们没有被蛋白质覆盖或保护，不受核酸酶的影响。”
据Rghei说，是Norgen's样本采集试剂盒需要大约80分钟才能产生结果，成本约为33美元。
总的来说，Diefenbach强调，这项研究是同类研究中首次使用大范围的插入DNA片段来检测商用cfDNA试剂盒。
该研究的作者补充说，“建立商业cfDNA试剂盒的性能，以恢复不同大小的DNA，对于优化循环DNA作为癌症生物标志物的效用很重要。”