纽约-由翻译基因组研究所(TGen)的研究人员领导的一个多实验室小组建立了一个液体活检框架，分析与儿童和胰腺癌相关的细胞游离DNA (cfDNA)的碎片模式。
该团队的非侵入性方法分析了患者尿液样本cfDNA中循环保护区域(RPR)内的片段末端，在区分癌症患者和健康受试者方面，产生了0.89 in的曲线下面积(AUC)。
该项目还包括来自凤凰城儿童医院、贝勒斯科特和怀特研究所和希望之城的研究人员。
Muhammad Murtaza现在是威斯康星大学麦迪逊分校人类基因组学中心的副教授，他解释说，他在TGen的团队最初争论的是尿液是否可以像血液一样作为cfDNA分析的充分分析物。
在原理证明研究中上个月发表的在《科学—转化医学》Murtaza和他的同事对健康患者的30个尿液和15个血浆样本进行全基因组测序(WGS)，以确定cfDNA片段的大小分布。
研究人员在血浆样本中观察到的平均片段大小为167 bp，而在尿液中发现的片段长度平均为80到81个碱基对。
Murtaza因此推测，尿液cfDNA由于某种程度的直接保护而免于降解。他还指出，血浆cfDNA的碎片模式与核小体定位和参与细胞的dna -蛋白质相互作用一致。
因此，研究小组决定观察已知的基因组中保守的不同区域，看看在尿液和血浆中的分布覆盖是什么样子的。
Murtaza说:“我们发现，在所有细胞中核小体位置都保持保守的基因组区域中，两个样本的覆盖率非常一致。”“虽然尿液中的峰值通常较窄，但它们与血浆样本中的峰值中心重叠。”
Murtaza的团队随后将分析范围扩大到整个基因组，有可能识别和比较血浆和尿液样本中保存的RPRs。研究人员发现，RPR峰值在不同样本之间重叠，而且在基于尿液的RPR图谱中，它们也独立于血浆存在。
穆尔塔扎和他的同事们然后推测尿液和血浆中的无细胞碎片是否保留了它们原细胞的DNA特征。因此，研究小组分析了血浆样本中淋巴母细胞系的开放和封闭染色质区域。
Murtaza说:“当你观察血浆时，平均而言，你会发现封闭染色质区域的片段尺寸比开放染色质区域的片段尺寸略长。”“我们在尿液样本中发现了类似的碎片大小趋势。”
然后，Murtaza的团队试图在整个基因组中识别局部的碎片差异。利用不同的细胞系、组织和DNA超敏位点，研究小组调查了血浆和尿液样本的相关性。
研究人员发现，与上皮细胞和尿液相比，血浆中淋巴细胞和髓细胞之间的相关性最高，这表明上皮细胞在尿液中贡献的cfDNA比血浆更多。
穆尔塔扎说:“这让我们确信，我们正在观察的碎片特征与导致碎片的细胞有关。”
Murtaza和他的同事们随后致力于观察血浆和尿液样本中的RPRs是否受到降解的保护。重要的是，他们发现RPR峰值和它们的中心在血浆中基本没有降解，而碎片末端落在整个基因组的外围。
穆尔塔扎说:“你可以在尿液中看到类似的东西，尽管RPR中心的保护可能更短暂，因为RPR中破裂的碎片比例更大。”“根据DNA与蛋白质结合的位置以及它们在细胞中的位置，DNA-蛋白质相互作用似乎产生了RPRs。”
穆尔塔扎的研究小组假设，因为癌症患者的组织类型不同，这些患者的细胞向尿液中贡献的DNA更多。他指出，癌细胞在DNA和蛋白质相互作用的地方存在差异。
该小组评估了8名健康患者和22名I-IV期癌症患者(10名儿童和12名胰腺癌)的尿液样本，注意到异常片段(FAF)在尿癌患者中的比例高于对照组。使用FAFs和片段末端基序的阈值，研究人员发现，在区分健康对照和癌症患者时，该方法产生的AUC为0.89。
Murtaza说:“这让我们有了区分癌症患者和健康患者的显著能力，当我们加入对我们观察到的核苷酸序列的多动态分析时，这种能力进一步得到了提高。”
为了确保基于片段的RPRs的升高与患者的肿瘤有关，而不是与其他生理反应有关，Murtaza的团队比较了基因组区域的FAFs与肿瘤DNA拷贝数的增加和减少。研究人员发现，在患者肿瘤DNA拷贝数增加的区域，尿液中的FAFs增加，即使拷贝数变化低于尿循环肿瘤DNA (ctDNA)检测的极限。
Murtaza指出:“这与患者患有早期疾病的事实相一致，我们没有预料到血浆或尿液中的肿瘤分数会很高。”“但我们确实看到，与丢失区域相比，获得区域的拷贝数中异常片段的比例升高了。”
然后穆尔塔扎想看看尿液样本是否可以在实验室之外收集，并且在降解模式方面仍然表现相似。研究人员选择了5名健康的志愿者，他们在家里收集了一份最初的排尿样本，当天晚些时候在实验室收集了一份后续的样本。
在将每个样品分成5个等分样品并在第一个等分样品中添加防腐剂后，研究小组在30分钟、60分钟、120分钟和240分钟的后续等分样品中添加防腐剂。
Murtaza和他的同事们发现，cfDNA的产量和片段大小分布不受收集尿液样本的杯子预先添加的防腐剂的影响。此外，在未使用防腐剂的情况下，尿液样品在收集后处理过程中至少持续了45分钟才降解。
然而，穆尔塔扎承认，这项研究有一定的局限性，包括样本量小和缺乏纵向数据。研究小组也没有记录在大多数样本的尿液收集过程中生物变异和分析前变异的来源。
虽然该方法可能有助于测量癌症患者的RPRs，但研究作者也承认，它可能无法可靠地捕获贡献细胞类型的核小体位置，包括上皮细胞和淋巴母细胞。
Murtaza说:“我们发现碎片化分析在尿液DNA中是可行的，只需要浅WGS，不像研究单个突变需要更深的测序。”“这限制了所需样本的数量，保持了较低的分析成本，并为进行更大规模的研究和最终的常规测试提供了一种快速的方法。”
穆尔塔扎和他的同事们现在正在研究他们能把这种方法推进到什么程度，看看需要多少测序才能测量血浆样本中的异常片段。虽然该小组将在更大的儿童和胰腺癌患者队列中验证该方法，但Murtaza指出，该方法并不局限于一种或两种肿瘤类型。
他补充说:“需要进行更大规模的前瞻性研究，使用适当的能量分析来开发一种DNA测试，以准确评估患者是否患有癌症。”
商业潜力
Murtaza和他的同事已经向美国专利和商标组织申请了一项专利，该专利用于分析尿液cfDNA的碎片模式。
Murtaza说:“我们希望，通过进一步的验证，我们可以在早期癌症检测中使用尿液异常碎片。”“尽管样本量很小，但所有5名癌症患者都有可能被切除。”
穆尔塔扎设想了一种临床工作流程，病人在定期去看医生时提取40至50毫升的尿液样本，然后医生将样本发送给TGen及其合作者。从10毫升尿样中提取cfDNA后，Murtaza的团队将进行全基因组库准备、WGS和数据分析，以确定患者是否有患症状前癌症的风险。
穆尔塔扎说，目前的工作流程需要大约两到三天的时间才能产生结果。然而，他承认，在分析之前，他的团队仍然需要建立一个参考对照数据集，以确定患者的模式是否差异足够大，从而确定患者是否可能发展为早期癌症。
虽然Murtaza说，现在决定基于尿液的检测方法的商业道路还为时过早，但他的团队有兴趣与将该方法商业化的合作伙伴合作。最终，他相信这种方法可以作为基于血浆的液体活检方法的补充，用于癌症的检测和监测。