纽约-加利福尼亚大学洛杉矶分校的研究人员已经改进了一种循环肿瘤细胞(CTC)纯化系统，通过识别肿瘤来源的细胞外囊泡(EVs)中的生物标志物来帮助检测患者的早期肝细胞癌(HCC)。
该两步过程被称为“EV Click Chip”，包括从患者血液样本中收集和纯化细胞外囊泡，然后对EV进行逆转录液滴数字PCR (RT-ddPCR)，以识别早期HCC生物标志物。
的点击芯片平台包括一种定制的微流控芯片，它集成了四氮抗体(Tz)接枝硅纳米线衬底和微通道网络，改变以诱导混沌混合。为了进行双正交连接介导的捕获，研究小组将反式环辛素(TCO)修饰的捕获抗体移植到液体样本(如血液或尿液)中的ev。当样品通过芯片时，Tz和TCO发生反应并与ev结合。
加州大学洛杉矶分校药理学教授、“点击芯片”发明者曾显荣(Hsian-Rong Tseng)解释说，他的团队探索了使用一种二硫化物裂解剂，它可以剪断抗体连接剂中嵌入的二硫化物键。通过破坏二硫键释放，hc衍生的ev被从芯片中洗脱出来，同时最小化杂质。
虽然Click Chip最初是被开发出来的，现在UCLA的团队仍在使用它来识别ctc中的基因重排，Tseng说他的团队也想专注于监测从肝硬化到早期HCC的转变。
因此，研究小组将该方法用于纯化hcc特异性ev而不是ctc。新方法还包含了定制的RT-ddPCR面板，以量化10个定义良好的hcc特异性mRNA转录物。
该研究的合著者、加州大学洛杉矶分校药理学系的助理研究员Yazhen Zhu解释说，研究团队将ev作为潜在生物标志物的来源，因为它们比ctc在更早的阶段从肿瘤脱落到患者的血液中。虽然ctc具有很高的表面积，具有多个潜在的生物标志物，但大多数EV只包含一个生物标志物，这需要将EV Click Chip与多个捕获抗体结合使用。
Tseng补充说:“我们希望直接针对肿瘤来源的EV，因此使用Click Chip化学方法来纯化EV，而不是基于抗原-抗体或免疫亲和力的EV分离方法。”
在一项验证研究中发表在自然通讯周一，Tseng和他的团队开发了一种抗体鸡尾酒，可以从临床血浆样本中识别和捕获HCC ev。研究人员包括在HCC ev中高表达的表面抗原标记物，包括抗epcam、抗asgpr1、抗cd147和抗gpc -3。
然后，研究小组将153名患者的150 μl血浆样本注入EV Click芯片，其中包括46名treatment-naïve HCC患者和对照组(包括肝硬化患者、无肝硬化的慢性乙型/丙型肝炎患者、其他有或无转移的癌症患者和健康捐赠者)。在将特定的hc电动汽车固定在Click Chip平台上之后，研究人员然后将目标电动汽车从芯片中洗脱出来。
为了避免来自非HCC特异性ev的信号，Tseng的团队在裂解血浆样本中收集的ev提取mRNA后，检测并量化了HCC特异性ev的基因表达。在使用Bio-Rad的QX200 ddPCR仪器运行定制面板后，研究小组分析数据，量化每个基因检测到的基因转录本的拷贝数，并计算数字评分，以区分HCC患者和高危肝硬化患者。
“我们没有使用传统的免疫组化方法来[收集ev]，而是使用抗体鸡尾酒来处理HCC细胞的异质性，”朱解释说。“EV可能更重要，因为它可能只有EpCAM、ASPGR1或CD147中的一种，因此你正在[建立]一种肿瘤特异性EV。”
研究人员发现，EV Click Chip用于早期HCC检测的临床敏感性为94%，特异性为89%，操作曲线下面积为0.93。
此外，Zhu强调，EV Click Chip将HCC与非癌症(肝硬化、慢性肝炎和健康捐赠者)和其他癌症人群区分开来，其临床敏感性约为96%，特异性为89%。
“这很重要，因为在肝癌中，你需要区分原发性肝癌和转移性肝癌，”朱说。“即使你从其他肝癌中分离出ev，我们也只能识别出HCC特异性的癌症，这使得我们能够很好地将HCC与其他癌症区分开来。”
然而，由于该研究的HCC队列相对较小，作者承认，他们将需要筛查更多的HCC患者，包括所有疾病病因，并进行纵向随访测试。
Tseng和他的同事也开始开发一种专有的HCC面板，他们相信这将提高平台的AUC和临床敏感性和特异性。研究人员将通过从机构生物库中收集含有ev的血液样本，对10到60个潜在的生物标志物进行额外的验证研究。
Tseng在一封电子邮件中说:“我们将首先在美国开始收集血液样本，因为我们与加州大学洛杉矶分校的罗纳德·里根医学中心、西达斯-西奈医学中心以及华盛顿大学都有合作。”与此同时，我们将探索与亚洲医疗机构的潜在合作。”
Tseng指出，EV Click Chip的表面标记可以替换为不同的肿瘤特异性标记，以捕获其他类型的肿瘤衍生EV。他的团队发现EV Click Chip可以通过应用不同的标记物来纯化尤文氏肉瘤和肝癌中的肿瘤源性EV。
Zhu说，该小组提出了一项回顾性研究来检查肝癌患者的病因，这将确定该平台对早期肝癌的诊断性能，以及对肝硬化、HPV和非酒精性脂肪肝患者的诊断性能。
Tseng强调，专注于EVs作为HCC的生物标志物的一个重要优势是，EVs可以很容易地保存在血清和血浆中，而CTCs往往受损或保存不正确。
Tseng说:“许多机构都有电动汽车的回顾性收藏……在过去的40年里，(它们)是数据库中注释最完善的(收藏)之一。”“我们相信，在这个平台上轻松进行回顾性研究将是一座金矿。”
虽然承认下一代基于测序的早期癌症检测方法可能提供高临床敏感性和特异性，Tseng指出，它们通常需要一到两周才能产生诊断结果。
同时，他强调，EV Click Chip与下游RT-ddPCR结合，只需要大约8小时就能产生诊断结果。该团队现在计划使用Qiagen公司的Qiacuity数字PCR系统将时间缩短到4小时。
Tseng指出，他的团队已经向美国专利商标局申请了EV Click Chip平台的临时专利。
如果未来的验证研究结果表明早期HCC检测的临床潜力，Tseng说，他的团队可能会从加州大学洛杉矶分校获得专利，并通过一家初创公司将该技术商业化。vwin德赢ac米兰合作Tseng认为，设想的检测方法将“与”实验室开发的检测方法“一致”，并由clia认证、cap认证的实验室提供。
由于该小组将观察到相对较少的生物标记物，Tseng指出，结合Click Chip，每次检测的成本可能明显低于基于测序的方法。
Tseng说:“这项技术将使vwin德赢ac米兰合作患者能够定期检测，而不是每天检测，但比WGS检测更容易，以监测他们从肝硬化发展为HCC的可能性。”“没有人能负担得起昂贵的化验，然后等两周才能得到报告。”