巴尔的摩-全球非营利组织FIND的任务是产生临床证据，以支持世界卫生组织在全球范围内使用下一代靶向测序技术进行耐药结核病(DR-TB)诊断的倡议，该组织一直在通过其名为seq & treatment的专门项目评估端到端NGS解决方案。
这个多年的项目，由1450万美元的拨款迄今为止，该项目已经吸引了来自先进生物实验室、基因筛选和牛津纳米孔技术公司的参与，以及来自Illumina公司的仪器支持。Seq&Treat在去年结束了最初的技术验证阶段，目前正在格鲁吉亚、南非和印度开展临床研究，在这些国家，基于ngs的耐药结核病诊断测试在Illumina和Oxford Nanopore平台上进行评估。
全球每年约有50万人口患上耐药结核病，其中只有56%的病例得到了成功治疗世卫组织的全球结核病报告．
尽管需要快速和准确的结核病药敏试验，但目前的护理标准——基于培养的方法——可以采取长达六周提供答案。近年来，基于探针的分子聚合酶链反应(PCR)检测已成为检测耐药性的一种更快的替代方法，但这些检测一次只能针对有限数量的基因。
相比之下，全基因组测序能够识别所有已知的耐药突变，但这种方法可能代价高昂，需要大量资源。FIND的测序项目负责人、seq & treatment项目的领头人Anita Suresh说，也就是说，有选择地对与结核病耐药性相关的常见基因特征进行测序的靶向测序可以为耐药结核病检测提供一种“足够快速但全面”的解决方案。
据Suresh说，Seq&Treat的目标是帮助世卫组织在全世界，特别是在低收入和中等收入国家实现耐药结核病快速、全面的靶向基因测序解决方案。Seq&Treat目前由来自10个不同国家的12名成员组成。Suresh说，该项目于2019年启动，通过国际药品采购机制提供的三年赠款维持，由于大流行造成的破坏，该赠款可能会至少延长一年。
Suresh说，Seq&Treat的初始任务包括公开招募正在开发结核病端到端NGS解决方案的制造商。Suresh说，尽管该项目没有规定测序平台和工作流程的组成部分，但根据世卫组织的NGS技术指南，所有提出的解决方案都必须满足目标产品配置标准。
在技术考察过程的最后，Seq&Trevwin德赢ac米兰合作at使用三种不同的测序平台确定了三种端到端DR-TB检测解决方案，包括法国生物技术公司GenoScreen在Illumina的MiSeq上的Deeplex Myc-TB测试，高级生物实验室在Illumina的iSeq上的工作流程，以及Oxford Nanopore使用MinIon测序仪的快速DR-TB检测方法。通过参与该项目，制造商获得了覆盖整个项目的资金，并有机会接受世卫组织的系统审查，这可能导致该组织建议进行耐药结核病检测。
“对我们来说，世卫组织的认可(将意味着)我们的试剂盒将被正式推荐在世界各地的国家结核病规划中实施，”基因筛查科学顾问兼科学顾问委员会成员Philip Supply说。他补充说，因此，该公司将“更有资格获得资助”，该产品将更容易被全球不同组织或卫生部采用。
据Supply公司介绍，基因筛选技术为Seq&Treat公司提出的解决方案是建立在Deeplex Myc-TB套件的基础上的在体外这是一种专为检测耐药结核病而设计的诊断试验，通过靶向扩增与13种抗结核药物对应的18种耐药相关基因，包括一线和二线结核病治疗药物。
供方说这个工具箱可以识别结核分枝杆菌它是结核病的罪魁祸首，还有100多种其他种类的分枝杆菌。此外，它可以通过结合靶向细菌CRISPR-Cas位点的spoligotyping技术和系统发育剪接技术，在谱系或亚谱系水平上鉴定结核病株的基因型。
Supply公司表示，简而言之，Deeplex Myc-TB的工作流程从使用Promega试剂提取DNA开始，然后使用Deeplex Myc-TB试剂盒进行24倍PCR扩增，并用Illumina文库准备试剂盒进行文库准备。测序后，fastq文件被上传到一个定制的数据分析软件，然后该软件进行“自动分析和用户友好的测序数据解释，”他补充说。
谈到产品的灵敏度，Supply表示，通过公司独立的Seq&Treat项目上的评价超过3500结核分枝杆菌在基因组方面，该试剂盒已证明能够捕获97%至99%的耐药表型，而这些表型可以通过全基因组测序来预测。
Supply还强调了靶向测序与全基因组测序相比的一些优势。他说，首先，因为靶向方法通过PCR扩增丰富了感兴趣的基因，它需要的起始材料更少。此外，他说，由于这种方法避免了对整个基因组进行测序，它可以对目标区域进行深度覆盖——每个序列位置最多可读取1000次或更多。Supply说:“这使得我们可以检测到样本中只存在于细菌种群中一小部分的突变。”
GenoScreen的研发项目经理Nelly Batadalo说，Deeplex Myc-TB试剂盒的另一个额外好处是，它可以检测检测覆盖的基因靶标中可能发生的新突变，这使研究人员可以研究尚未确定但可能与耐药性有关的突变。
Batadalo表示，在2019年获得CE-IVD认证后，Deeplex Myc-TB套件已部署到全球五大洲的35个国家。虽然世卫组织没有正式推荐该试剂盒通过seq & treatment项目进行RD-TB检测，但Supply指出，世卫组织已经在分别在吉布提、厄立特里亚和刚果民主共和国进行的其他三个耐药性调查中使用了该试剂盒。
Batadalo说，该套件主要使用Illumina平台设计。虽然提交给Seq&Treat的工作流程是与MiSeq配套的，但她说该套件也兼容其他测序仪，包括iSeq 100和NextSeq。根据平台的不同，一次运行的吞吐量可以从3个样本到384个样本，周转时间不到48小时。
Supply承认，Deeplex Myc-TB套件理论上与牛津纳米孔平台兼容，但他不建议这样做。他解释说:“牛津纳米孔(平台)由于测序精度的限制，性能要低得多。”
与此同时，牛津纳米孔公司也参与了Seq&Treat项目，提交了其工作流程进行评估。“牛津纳米孔测序平台是[低收入和中等收入国家]部署的理想选择，因为它们的可访问性、便携性和易用性;在速度和吞吐量灵活性方面，它也比其他测序技术有优势，”公司发言人在一封电子邮件中说。
据该公司转化应用高级总监Justin O’grady介绍，该工作流程自2019年以来一直在与Quadram生物科学研究所(QIB)合作开发，还使用多重PCR扩增16个基因分枝杆菌可能包含已知与一线和二线抗结核药物耐药相关的突变的结核病基因组。
O'Grady在一封电子邮件中说，该工作流程直接在痰液上执行，有一个定制的分析管道，可以快速执行分析，哪个不需要网络连接．这可能使它特别适合牛津纳米孔靶向的低资源社区作为一种可饮用和可获得的测试。他还指出，研究表明，单核苷酸多态性可以通过纳米孔测序“快速识别”，抗结核药物耐药性也可以“准确预测”。
尽管O’grady拒绝对基于Illumina测序的方法发表评论，但他说Oxford Nanopore的方法“非常快”，周转时间不到5个小时，而且“准确、方便、易于执行”。据Oxford Nanopore表示，该公司的靶向测序方案通过达到或超过WHO性能目标，成功地完成了Seq&Treat的分析评估，该目标要求超过98%的基因型敏感性和特异性，检测细胞限制小于1000个，失败率为零，并能够实现超过10%的异耐药检测。
此外，牛津纳米孔公司的一位发言人说，他们的DR-TB靶向测序方法正在ISO13485流程下开发，并补充说该公司“有能力开发CE-IVD产品”。
Illumina公司的全球健康高级总监Vanessa Moeder说，该公司没有参与Seq&Treat的解决方案开发，但已经在格鲁吉亚、南非和印度的三个试验点捐赠了6个仪器，每个试验点接收了一个iSeq和一个MiSeq。
Suresh说，为了在项目早期阶段实现这三种方法的技术验证和优化，FIND向制造商提供了一个盲法参考面板，并补充说，结果随后报告给FIND，并由FIND任命的独立专家小组技术审查委员会进行审查。技术审查委员会由FIND任命，以评估这些解决方案的性能。
在确定解决方案的技术有效性后，Seq&Treat启动了提交工作流程的临床验证阶段，在耐药结核病负担相对较高的三个试验地点启动了临床试验。Suresh说，临床研究的目标是在这三个国家的700至800份与耐药结核病相关的临床痰液样本上测试三种耐药结核病诊断方法，以生成每种工作流程的性能证据，特别是在它们的敏感性和特异性方面。
Suresh说，这三个国家代表着耐药结核病诊断的独特挑战。她解释说，在南非，结核病与艾滋病毒和梅毒等其他传染病之间有很大的重叠。她还说，在格鲁吉亚，耐多药结核病(MDR)患病率很高，尽管总体结核病负担相对较低。同时，在印度，结核病和耐药结核病的风险都很高。
Suresh说，为了简化临床研究，收集的痰样本首先进行相对耗时的参考检测，包括培养和全基因组测序，以及上游用于耐药结核病筛查的Xpert MTB/RIF和SL-LPA Line探针检测。同时，样品将在下游提交的测序解决方案上进行别名测试。苏雷什说，尽管COVID-19带来了障碍和延误，但所有临床地点的患者招募工作已接近尾声，每个国家将收集200多个样本。她补充说，目前，这些网站正在建立靶向测序解决方案，以测试其性能。
Suresh还明确表示，这些临床试验仅仅是观察性研究，这意味着占参与者大多数的耐药结核病患者仍将接受与其诊断相关的标准护理。
Suresh说，尽管这些临床试验是由单个制造商独立执行的，但它们与公司运行的试验不同，因为FIND将在研究结论后分析结果，并将其作为证据档案提交给世卫组织指南制定小组进行独立的数据审查。Suresh指出，在整个临床评估过程中，FIND还在一定程度上扮演着临床研究管理者和观察者的角色，确保被评估产品进入研究地点的基本途径，确定标准操作程序，并确保试验遵循良好的临床实践标准。
除了解决方案的临床表现外，创新诊断方法还将对为世卫组织准备的证据档案中的解决方案进行成本分析和可用性研究。Suresh说，根据FIND最后提出的全面证据，世卫组织将决定是否为在全世界使用耐药结核病诊断的这三种解决方案中的每一种提出政策建议。
作为seq和treat项目的另一项主要成果，Suresh说，她的团队还将与世卫组织合作，起草关于对个别国家使用基于国家卫生组织的有针对性的耐药结核病检测的实施指南，该指南有望在今年晚些时候发布。
为此，她说，尽管Seq&Treat项目为耐药结核病诊断部署了靶向测序，但实施指南将强调使用靶向测序进行监测。Suresh解释说，首次投资于测序源的国家通常更倾向于将该技术用于疾病监测，因为它更容易实现，而且没有患者等待立即得到结果。vwin德赢ac米兰合作
尽管如此，她认为在低收入和中等收入国家实施耐药结核病靶向测序可能受益于COVID-19大流行增加的测序基础设施。在大流行期间，发现基金会开展了一项运动系统的映射在世卫组织和其他组织的投入下，评估现有的全球SARS-CoV-2基因组测序能力。根据收集到的数据，Suresh说，她预计测序仪的安装基数将“急剧增加”，特别是在低收入和中等收入国家。随着COVID-19的消退和检测需求的下降，Suresh预计这些测序器将更容易用于诊断包括结核病在内的其他疾病。
Suresh说，除了实施之外，抗击耐药结核病的另一项重要努力是加强全球对这种疾病的临床知识库。对于这一举措，Suresh强调了Seq&Treat去年的另一个重要里程碑结核病突变目录与世卫组织。Suresh说:“这是第一个此类目录。”他补充说，该目录建立在30多年的监测数据基础上，包含了近5万种耐药结核毒株，不仅可以作为耐药结核突变的明确参考，还可以作为其他耐药病原体的“探路者”。随着新的结核病治疗方案继续在世界不同地区推出，随之而来的是新的耐药基因，Suresh说目录将继续更新，第二版有望在今年年底发布。
除了Seq&Treat项目(该项目将于明年左右结束)，Suresh说，FIND将继续促进和促进低收入和中等收入国家实施针对耐药结核病的有针对性的NGS解决方案。尽管Suresh认为Seq&Treat的实施指导将足以让一些国家采用工作流程，但其他国家可能仍需要进一步研究和支持。
Suresh说，例如，Seq&Treat所包括的临床站点都是国家的中心参考实验室，拥有成熟的检测基础设施和充足的结核病诊断知识。但是，当在卫生系统分散化的国家部署这些解决方案时，如何从不同的检测设施之间运输样本，以及如何精简地向患者报告结果，可能仍然需要进一步优化。
此外，考虑到Seq&Treat中包含的检测方案与其提议的regents和协议相一致，Suresh说，未来仍需要进行等效性研究，以评估其他用于基于ngs的靶向耐药结核病检测方法的DNA提取、PCR扩增、文库准备和数据分析方案。
“我们已经评估了三个(工作流程)。希望有更多的公司或更多的协议组合出现。”Suresh说。