纽约(基因组网)-来自韦恩州立大学和密歇根皇家岛国家公园的一个团队证明了使用离子激流测序来评估引入环境的微生物群落样本的可行性。
“离子激流问世时，很多人都很挣扎，”该研究的第一作者、韦恩州立大学的生理学研究员藤本正里(Masanori Fujimoto)说按顺序．“但这种400碱基的化学反应可以做得更好，而且成本更低。”
“这将加速对微生物群的研究，”他补充说。
为他们的研究发表在《公共科学图书馆•综合》本月，Fujimoto和他的同事们将注意力集中在五大湖货船释放的压舱水样本上，这些压舱水经过了氢氧化钠处理，他们使用了赛默飞世尔科学公司的Ion Torrent PGM仪器，对来自四个压舱舱的几十个样本进行了16S核蛋白体RNA测序，这些压舱舱有或没有经过氢氧化钠处理。
该团队的测序结果显示，与罗氏454 GS FLX仪器16S基因测序检测到的微生物群落成员相匹配。特别是，结果显示，碱性压载水中的微生物多样性低于通常水平，而且来自单一属的成员增加Alishewanella．
Fujimoto解释说，在过去，基于16S核糖体RNA基因识别环境微生物群落中的生物的测序方法是昂贵和劳动密集型的。他补充说，随着下一代测序技术的引入，成本下降了，吞吐量增加了，尽管考虑到许多样本，价格标签仍然很高。
因此，该团队决定研究一种相对便宜的测序技术——Ion Torrent PGM——的适用性，以识别微生物群落成分，这是一项更广泛的研究的一部分，研究用氢氧化钠处理压载水的效果。vwin德赢ac米兰合作
这些水被用来稳定一艘空货船，并在船只到达港口装填时释放到环境中，有可能将非本地物种和潜在致病微生物从一个地区传播到另一个地区。
人们提出了几种不同的处理方案来解决这个问题——从过滤和紫外线应用到氯或氢氧化钠处理。Fujimoto说，理想情况下，研究人员希望了解这种处理方法的后果，以帮助制定规定，制定有效的水处理方法，以一种成本效益高的方式进行。
“我们想要有效地处理水，尽量减少外来物种的引入，”他解释说，“但与此同时，我们不想给船东和工业带来太多负担。”
为了更深入地研究压舱水的碱处理和通过Ion Torrent PGM产生的读取来评估微生物群落成员的有效性，研究人员使用了400碱基的Ion Torrent化学试剂去年推出的对两个碱(氢氧化钠处理)压载舱和两个未处理对照舱的进气和排出样品进行16S rRNA测序。
他们的Ion Torrent实验瞄准了微生物16S rRNA基因的V4和V5区域，使用了与该测序系统兼容的引物。
由于死亡微生物和植物细胞的DNA有时仍会出现在水样中，研究小组对每种情况下的重复样本进行了DNA交联剂处理，这种DNA交联剂不能穿过活细菌的细胞膜。
总的来说，研究人员在Ion Torrent PGM和314芯片上进行了两次测序，对近36个条形码样本和细菌对照进行了测序，产生了超过580,600个高质量的Ion Torrent reads，平均每个reads约380个碱基。
当他们仔细研究这些数据(平均每个样本包含近18800个读取)时，他们求助于可用的校准映射方法、来自核糖体数据库项目(RDP)的参考信息和完善的QIIME管道来识别每个微生物群落的成员并确定它们的多样性。
藤本指出，这些分析方法需要一些调整，因为当研究完成时，用于处理16S序列数据的生物信息学管道被设计为处理在罗氏454或Illumina仪器上产生的读取。
虽然一些分析方法已经更新了离子激流读取输入，项目的信息学方面在当时是“一个主要的挑战”，他说。“我们必须找到一种方法，将这些输出(原始读取)数据加载到现有的管道中。”
例如，藤本解释说，该团队必须找到将与离子激流序列读取相关的质量分数转换为分析管道识别的分数的方法。此外，还需要对用于离子激流测序的条形码类型进行额外的修改，以处理微妙的差异。
在已知细菌种类的样品中，例如由霍乱弧菌从纯粹的文化中，团队看到了真实诉霍乱99.94%的读取来自第一次运行，99.82%的读取来自第二次运行。
当他们比较处理前后压载水样本中的微生物群落时，研究人员发现，从未经处理的压载水水箱中取出的样本中含有的细菌，比在进水时收集的样本中含有的细菌更多。
另一方面，碱压载水样本的微生物多样性显著降低，与细菌相关的读数急剧上升Alishewanella在氢氧化钠处理后的压载水样本中发现的读数超过一半。
仔细观察后一种微生物的系统发育，至少发现了三种Alishewanella碱水样品中过去未描述的物种。
处理过的样品也倾向于携带来自假单胞菌还有其他的-变形菌门芽孢杆菌以及厚壁菌门的其他属。吸入和排出的样本似乎都不包含潜在病原体的序列埃希氏杆菌属，肠球菌,或弧菌属。
同时，对经DNA交联剂处理的样品进行观察发现，进水中容易含有含有叶绿体DNA的死亡蓝藻细胞，这些蓝藻细胞可通过16S rRNA测序得到。
作为用于产生这些微生物组图谱的测序技术的比较，研究人员在罗氏454 vwin德赢ac米兰合作GS FLX仪器上通过16S rRNA测序测试了原始氢氧化钠处理和未处理压载水样本的子集，这次放大了16S基因的V1和V2区域。
分析结果与基于Ion torrent对处理前后压载水样本的观察结果吻合良好，激发了人们对使用该方法评估这些和其他环境地点微生物表现的前景的热情。
藤本说:“他们报告的群落几乎相同，尽管16S(基因)中的区域不同。”“我们得到的结果，我们得到的社区资料，几乎是一样的。”
“这项研究显示了碱压载水处理在减少压载水微生物多样性方面的效果，”他和他的同事写道，“并展示了新的离子激流测序技术在微生物群落研究中的应用。”
目前的分析是使用314芯片完成的，每次运行大约产生100万次读取。
自那以后，Ion Torrent已经引入了316和318个芯片，在一次Ion Torrent运行中产生高达1000万次读取，藤本指出，每个样本的最终覆盖深度取决于所选择的芯片和在给定运行中包含的条形码样本的数量。
的16S测序实验《公共科学图书馆•综合》在研究中，该小组认为他们已经达到了测序饱和，检测到在给定压载水样本中存在的绝大多数微生物。
尽管如此，藤本指出，人们可以使用同样的引物组对316或318芯片进行16S rRNA基因测序，这将在一些情况下提供优势，从相对罕见的生物体的解读由于缺乏覆盖或当在一次运行中查看更大的条形码样本集时，由于缺乏覆盖而错过。
目前，他和他的同事每运行一次离子激流大约花费700到900美元，包括试剂成本。相比之下，在罗氏454仪器上进行同样的实验预计将花费几千美元。
该团队正在继续使用离子激流仪器进行16S rRNA测序工作，观察压舱水氯处理前后发现的微生物群落成员。
研究人员还对从五大湖托莱多湾收集的样本进行了18S基因测序实验，这是另一个项目的一部分，该项目的重点是在该地区寻找非本地真核生物物种。此外，他们计划使用离子激流(Ion Torrent)仪器对环境DNA (eDNA)样本中的DNA元条形码进行测序，作为研究水生入侵鱼类物种的单独努力的一部分。
“下一代测序技术在压载水处理中的应用，只是我们打算如何应用环境DNA高通量测序的一个例子，以更好地了解水生环境中的生物，以及它们如何随着位置、季节和入侵物种等人类影响而变化，”该研究的资深作者杰弗里·拉姆(Jeffrey Ram)在一封电子邮件中说。他也来自韦恩州立大学。