纽约(GenomeWeb)——在对65例移植患者的前瞻性研究中，斯坦福大学一种对循环DNA进行测序以非侵入性检测心脏移植排斥反应的方法已证明其准确性与金标准心内心肌活检检测相同。
这项研究是由斯坦福大学的斯蒂芬·奎克和基兰·库什领导的团队进行的今天公布的在科学转化医学．
奎克和库什领导的研究小组开发了这种测序方法，这种方法能够将捐赠器官的DNA与受赠者自己的DNA区分开来，并能检测出表明移植排斥的供者DNA比例峰值，并发表了一篇早期文章回顾性评价2011年。当时，该团队获得了NIH为期三年的资助，用于对该试验进行前瞻性验证。
在他们的新研究中，研究人员描述了这一验证的结果，发现与目前的金标准诊断活检结果相比，测序方法可以准确诊断急性排斥反应，并优于基于基因表达的排斥反应监测。
Khush说:“我们已经证明，这种试验可以作为急性排斥反应的一个非常准确的标记。临床测序新闻这个星期。然而，她说，“任何诊断测试在被广泛采用之前，总是需要进一步的验证，以及真正的临床效用研究。”
她补充说，该组织正在为这样一个项目寻求资金，但还没有具体的多中心临床验证计划。
斯坦福大学的研究小组利用次世代测序技术，通过寻找不同的SNPs来区分供体和受体的DNA。收集供体和受体基因型以确定区分snp。然后，在对受体血液中的循环细胞游离DNA进行测序后，研究人员计算供体和受体之间不同SNP位置的reads数，以确定供体DNA的比例。
在他们对这种方法的初步研究中，研究小组证实，提高供体DNA水平可以用于诊断排斥反应。
据Khush说，该小组的方法自从他们最初发表该方法以来已经在许多方面发生了变化。她说，在最初的实验中，该团队手工进行了DNA分离和文库准备，但后来将这些步骤自动化了。
测序技术的改进，从Illumina GA到Illumivwin德赢ac米兰合作na HiSeq2000和2500，也提高了测定的准确性，Khush说，以及用于分析测序数据的算法的进步。
“如果你回顾我们的回顾性研究，判定阳性的门槛要高得多，因为固有错误率要高得多，”Khush说。
在他们的前瞻性研究中，研究小组对斯坦福大学在三年内收治的所有心脏移植患者进行了测试。库什说，该组织总共招募了约120名受试者，但出于研究的目的扫描隧道显微镜研究只分析了其中的63例——21例儿科病例和44例成人病例。
研究人员从研究队列中收集了总共565个连续的血液样本，并对其进行了无细胞DNA测序分析，将结果与心肌内膜活检的诊断结果进行比较。
该研究的作者称，在排除了技术误差较大的样本和移植后14天内收集的样本后，在无细胞循环DNA阈值为0.25%时，该小组计算了测序分析的接受者工作特征曲线下的面积为0.83。
研究小组报告说，与活检相比，该检测方法的敏感性与不同病理学家对单个活检评估的一致性率相当。该小组写道:“人们不能指望其他任何测试的表现比这更好，即使是‘完美’的测试。”
研究人员还报告说，测序分析的性能似乎随着移植后的时间而改善，在移植后4个月或更长时间达到0.91的AUC。此外，该检测与活检的一致性在年轻患者中较高，并随着患者年龄的增长而降低。
此外，研究小组还调查了这种方法在急性排斥反应早期诊断中的潜力，检查了在中度或重度排斥反应发作前采集的样本中游离细胞DNA的模式。他们发现，在排异事件发生前五个月收集的样本中，供者DNA的比例显著升高。
根据Khush的说法，将该检测方法应用于临床的主要下一步是进行额外的验证和临床效用研究。
目前这种测试依赖于散弹枪测序，Khush说，这是一个优势，因为它的广度允许多用途分析诊断急性排斥反应和其他混杂情况，如病毒或细菌感染。“这与临床相关，因为有时患者会出现非特异性症状，我们不知道他们是否有急性排斥反应或感染。因为他们的免疫功能受到抑制，所以这两种疾病都有风险，”Khush说。
在一个最近的研究在细胞她和她的同事发表了一项数据，该数据来自对移植患者循环DNA中病毒序列的分析，使用的是同样的无细胞DNA方法。
另一方面，Khush说，在心脏移植患者的临床管理背景下，全基因组测序可能仍然太过繁琐和昂贵，因此调整分析来利用其他方法，如靶向测序可能是另一个步骤。
斯坦福大学研究小组的方法得到了分子诊断公司CareDx的许可，该公司销售一种基于基因表达的心脏移植排斥反应诊断方法，称为AlloMap。今年早些时候，该公司收购了移植诊断公司ImmuMetrix。ImmuMetrix的创始人是斯坦福大学的奎克，奎克现在是CareDx的科学顾问。
Khush说，CareDx可能计划在准备商业化之前进行更多的内部测试和检测方法的开发。
截至发稿前，CareDx公司没有就斯坦福循环DNA测序方法的商业化计划做出回应。
本周早些时候，该公司宣布了一项供应协议与Illumina合作开发下一代测序技术。该公司总裁兼首席执行官Peter Maag当时表示，随着CareDx产品从基于基因表达的AlloMap扩展到基于细胞的dna检测，Illumina的测序技术将支持研发和商业化vwin德赢ac米兰合作工作。
据Khush说，斯坦福大学的研究小组还在探索他们的实验在其他类型的实体器官移植中的应用。在招募心脏移植患者进行前瞻性研究的同时，研究人员也同时招募了大约80名肺癌患者，并对这些数据进行了类似的分析。
Khush说，肺移植提供了一个更棘手的目标，因为移植物暴露在环境中，因此，受移植者血液中无细胞供者的DNA水平可能会上升，这不仅是因为器官排斥，还因为移植器官的感染。
然而，她说，考虑到该小组的测序方法，“它应该与任何实体器官移植有关，你要通过分析供体细胞死亡来寻找移植物损伤的证据。”