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当它接近尾声时在第二阶段，布罗德研究所的RNAi联盟已经开始为下一阶段的工作做准备，即为生物研究开发RNAi技术。
TRC项目负责人David Root说，虽然所谓的TRC3的确切目标尚未确定，但该计划预计将扩大其范围，包括靶向非编码rna的试剂基因沉默新闻上周。
他解释说:“我们正在……更多地了解到底是什么构成了完整的哺乳动物转录组。”他指出，深度测序和其他方法已经揭示了“大量”以前未被识别的ncrna，而Broad和其他地方的工作“已经表明，这些……可能像许多人怀疑的那样，在功能上非常重要。”
Root指出，尽管mirna最近受到了广泛关注，越来越多的证据表明它们在许多生物过程和疾病中起着关键作用，但还有其他各种ncrna被发现，包括被称为大型基因间非编码rna的ncrna。
2009年，Broad的研究人员报道在自然使用“染色质状态图来发现干预已知蛋白质编码位点的离散转录单位……[这]在四种小鼠细胞类型中鉴定了大约1600个大型多外显子rna。”
他们写道，作为这项工作的一部分，研究小组确定了“lincRNAs在从胚胎干细胞多能性到细胞增殖的过程中发挥的多种作用”。
根据这项研究和其他工作，TRC打算扩展其针对人类和小鼠基因的慢病毒表达shrna的不断增长的文库，也针对非编码基因组，同时也在适当的情况下探索其他抑制ncRNA的技术，鲁特说。
“抑制转录的主要工具是短发夹rna，”他说。“我们已经发现这些基因可以有效对抗非编码rna，所以它仍将是基因库的核心。但当然，我们正在研究其他类型的工具来抑制基因功能，”例如，在mirna的情况下。
鲁特说，TRC3公司将开始建立一个用于功能获得实验的试剂库，这与其使用RNAi进行基因扰动的主要关注点有更大的不同。在Broad，“我们一直在RNAi联盟之外研究[开放阅读框架]库，但我们想让这成为[联盟]努力的一部分，”他说。
“与抑制转录相辅相成的是过度表达，”他指出。“人们已经这样做了一段时间，但我认为仍有很大的空间来改进使用过表达结构的基于功能获得细胞的筛选资源。我们正在努力，并将使其成为第三阶段的一部分。”
然而，到目前为止，TRC3的任务还没有完全确定。
认识到“有许多事情将使RNAi工具在生物发现方面更加强大……我们正在将[下一阶段]及其成员结合起来，[同时]定义和细化目标，”鲁特说。到目前为止，TRC3“还没有被锁定，可以这么说，它到底会是什么样子。”
然而，计划的下一阶段预计将在RNAi联盟目前正在进行的第二阶段于4月1日结束后立即开始。
建立联盟
2004年初，Broad成立了TRC，这是一个由RNAi研究人员组成的公共/私人联盟，专注于开发和公开针对小鼠和人类基因的病毒表达shrna的基因组规模集(内脏大神经4/9/2004）.
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在第一个三年阶段，TRC创建了一个约160,000个shrna的文库，用于大约32,000个人类和小鼠基因，可从Sigma-Aldrich和赛默飞世尔科学公司的开放生物系统部门获得。同时，TRC开发了使用该库进行功能丧失基因筛选的方法。
TRC1的成员包括哈佛医学院、麻省理工学院、达纳-法伯癌症研究所、麻省总医院、怀特黑德生物医学研究所、百时美施贵宝、安大略癌症研究所、西格玛-奥尔德里奇vwin德赢ac米兰合作和台湾中央研究院。诺华和礼来也参与其中。
2007年，TRC开始了第二个四年阶段，重点是提高“该图书馆作为筛选资源的能力”，鲁特上周说。
为了做到这一点，TRC2开始扩展图书馆。他说:“当然，每个基因的shrna越多，每个基因的独立测量就越多，监测脱靶效应的方法也就越多。”“这让你有更多的机会设计出高效的发卡……这种发卡具有强大的冲击力和分布能力。”
TRC2正在将其shRNA文库的规模扩大一倍，不仅将每个基因的平均shRNA数量从5个增加到8个，而且还增加了目标基因的总体数量。
鲁特指出:“在TRC1和TRC2之间的时间里，人类和小鼠的基因组都有了改进，并且有了关于[最]可靠的基因和转录序列的新信息。”“因此，我们增加了8000个新基因，一旦TRC2在4月份完成，TRC2文库将覆盖4万个小鼠和人类目标。”
与此同时，TRC2采取措施全面验证其库中的shrna。
鲁特说:“我们实际上已经获得了近10万个shrna的[敲除测量]数据”，目标是近1.6万个不同的基因。到该联盟第二阶段结束时，将近15万个shrna和大约2万个基因将得到验证。
“在如此大量的shrna上进行这些敲除测量的价值是多重的，”他说。“当然，我们对文库的总体表现有非常好的统计数据，但对于我们所针对的大部分基因，我们有一个基因逐个基因的评估，评估我们的文库覆盖这些基因的程度。
他补充说:“除此之外，因为我们对shrna的敲除有定量评估……当你实际使用这些文库进行生物学发现时，你可以在一个基因一个基因的基础上，将你所看到的表型与目标基因的敲除程度进行比较。”
尽管改进shRNA库是TRC2的主要目标，但TRC2也有一些辅助项目，围绕着提高对shRNA设计和处理的整体理解，这“显然有助于能够创建最好的库，”Root说。
“为了做到这一点……我们创建了超过1000个使用较少偏见设计的shrna，以研究设计shrna的最佳规则，主要关注的是应该瞄准的目标序列，但也关注其他一些设计参数，如环和茎的长度。”
他补充说，TRC2的研究人员还检查了慢病毒传递的shrna是如何处理的，感染细胞，然后从细胞中创建可以与发夹相匹配的小rna文库。
在第二阶段，该联盟也一直在开发更好的方法，将其shRNA库应用于筛选实验，包括联合筛选方法。
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Root说:“其他研究shrna的小组已经研究了一段时间……但我们一直在努力推进前沿，以便能够高效、有效地筛选大量shrna，并从这些汇集的屏幕中获得非常可靠的答案。”
2008年，TRC2出版了一份纸在美国国家科学院院刊详细介绍了在不同癌细胞系中获得的工作和结果，并且联盟研究人员最近提交了一篇关于使用更大shRNA池筛选方法的新论文，他指出。
鲁特补充说，预计在不久的将来还将发表有关TRC库中使用的shRNA载体的诱导版本的数据，这些数据可用于“后续实验和特殊目的”。“它工作得很好……而且很紧，所以你可以几乎完全关闭它，”并且已经进行了测试在体外在老鼠身上也是如此。
哈佛医学院、麻省理工学院、达纳-法伯、马萨诸塞州总医院、怀特黑德、百时美施贵宝、安大略省癌症研究所、西格玛-奥德里奇和中央研究院，以及新成员强生公司，都是TRC2的成员。诺华和礼来没有参与第二阶段的研究。
距离TRC2的结论还有不到一年的时间，来自这些项目的数据和来自联盟成员的反馈有望帮助起草TRC3的蓝图。
最终，“我们将做最重要的事情，让RNAi在我们和其他生物研究界想要做的生物发现实验中尽可能强大，”鲁特说。