纽约(基因组网)-根据克里斯蒂安娜保健卫生系统基因编辑研究所科学家发表的研究，CRISPR/Cas9可以帮助提高由单链DNA寡核苷酸(ssODNs)指导的单核苷酸编辑方法的效率。虽然该方法可以帮助编辑导致人类疾病的点突变，但它容易在Cas9切割位点留下内嵌。
基因编辑研究所的Eric Kmiec告诉GenomeWeb，如果这听起来像是基因通过同源定向修复途径敲入，那么请三思。“Oligos可以修复点突变，而不必完全插入DNA，”他说。“我们的方法是由同源性指导的，但称之为同源导向修复是有误导性的，因为它意味着整个寡核苷酸都被插入。”
相反，这种被称为靶向基因改变的方法利用细胞的错配修复机制来改变单个碱基。通过插入一个ssODN，该ssODN除了一个核苷酸之外完全与目标序列杂交，就会产生不匹配，而这种不匹配应该由细胞修复。
“我们对点突变修复感兴趣，”Kmiec说，“而不是编辑基因组的大片段。我们认为这是一个略有不同的途径。这更像是一种修复点突变的手术方法。”
在这个意义上，它有点像无核酸酶的Cas9(dCas9)与胞苷脱氨酶融合哈佛大学的David Liu说。但与没有切割活动的策略不同，Kmiec的方法在双链断裂放置在靠近DNA目标的35到50个碱基内时效果最好。
这是Kmiec在过去几年领导的研究的发现之一。虽然Kmiec和他的同事已经证明了Cas9是制造DSB的一个很好的选择，但它并不是唯一的方法。他们还使用了转录激活物样效应核酸酶(TALENs)，根据乌尔姆大学医院科学家克劳斯·施瓦茨领导的一项研究，添加DSB来辅助ssodn指导的编辑的想法至少可以追溯到2006年分子治疗．
而靶向基因改变的历史甚至可以追溯到更早的时候，这使得它成为基因治疗中编辑点突变的一个有吸引力的选择。Kmiec说:“这种东西已经存在20年了。”他的方法与反义ssODN疗法有许多相似之处，这一事实也很有前景，因为美国食品和药物管理局已经批准它们用于人类。
发表在《公共科学图书馆•综合》2015年6月，Kmiec领导的团队发现，Cas9断裂可以提高ssodn定向修复的速度，即使与类似的talen辅助策略相比也是如此。但这并不是他们发现的全部。Cas9的灵活性和低成本帮助他们提取了大量关于修复机制的信息:与非转录链杂交的ssODNs比靶向转录链的ssODNs导致更多的突变修复;卵裂必须接近-在50个碱基内-基因目标;DSB比单链切口更好。
Kmiec不仅研究了点修正，还研究了Cas9的裂解位点。在本月早些时候发表的一项研究中科学报告， Kmiec和他的同事描述了对人类基因血红蛋白β (HBB)中ssodn定向点突变修复的进一步分析。
他说:“CRISPR/Cas9有一种有趣的能力(在被切割的部位)做事情，”导致各种突变，但ssODNs的添加使CRISPR/Cas9在目标部位的诱变性降低。
这有两个含义。首先，Cas9可以在切割部位引入自己的突变，这不会让该领域的任何人感到震惊。此外，更令人惊讶的是，寡核苷酸改变了Cas9切割部位的DNA修复动力学。
Kmeic说，这种寡核苷酸有助于更干净地切割，“就像用创可贴把末端粘在一起一样”，并防止NHEJ插入或删除核苷酸。这是一个侧面的观察。但我们继续跟进，发现CRISPR和寡核苷酸的组合对从事这类工作的人来说更适用。”
如果情况属实，这只是其中之一有趣的DNA修复相关发现从CRISPR/Cas9实验中跳出来。一个加州大学伯克利分校的科学家雅各布·科恩报道说提出了类似于硬币反面的发现，即没有同源性的短合成寡核苷酸的存在实际上有助于诱变，在使用Cas9时导致更有效的敲除。
Kmiec的团队在研究HBB基因的编辑过程中发现了oligo-Cas9的切割位点连接，HBB是基因编辑领域许多人感兴趣的基因。虽然在一些情况下，他们能够在没有Cas9切割位点突变的情况下进行点编辑，但在其他情况下，他发现了“整个indels种群”。这是一个重要的提醒，那些希望在临床编辑中使用CRISPR/Cas9的人应该小心。
他说:“CRISPR/Cas9是快速和邪恶的。“你最好看看伤口有什么附带伤害。”
尽管如此，Kmiec说他“非常谨慎乐观”，他可以继续推动oligo-Cas9组合的临床应用。
他说:“(cas9诱导的突变)对这项技术不是负面影响，只是需要讨论一下。”vwin德赢ac米兰合作特别是与基因治疗早期黑暗的日子相比，从他的实验室和其他地方传来的好消息已经足够多了，他觉得自己并没有给自己的基因编辑方法泼冷水。他说:“聪明的人将能够找到绕过它的方法。”
他已经在进行后续研究，并看到了大量完美纠正的点突变，没有附带损害。