纽约-一种CRISPR-Cas变体，经过工程改造，不再需要原间隔相邻基序(PAM)，可以利用它在任何DNA碱基上进行切割在体外一项新的研究报告称。它在任何地方进行精确断裂的能力可以应用于许多DNA工程应用。
马萨诸塞州总医院的研究人员设计了这种几乎没有pam的变体，他们将其命名为SpRY他们在2020年报告．通常，野生型CRISPR-Cas9或-Cas12核酸酶需要在靶位点附近的PAM的识别，这限制了酶的分裂位置。同样，限制性内切酶只能切割特定的DNA基序。
”在体外这意味着作为研究人员，我们不能完全灵活地在任何序列上切割DNA，因为我们用作工具的酶受制于这些短序列基序，”高级作者本杰明·克莱因弗(Benjamin kleinver)在一封电子邮件中说，他是MGH的助理研究员。
相比之下，SpRY有更宽松的要求。在一项新的研究中出现在自然生物技术vwin德赢ac米兰合作周四克莱因弗和他的同事报告说，SpRY DNA消化系统(SpRYgests)几乎可以切割任何DNA序列在体外用引导RNA。研究人员进一步优化了SpRYgest流程，包括gRNA的生产，以改善工作流程，使其得到更广泛的采用。
作为他们分析的一部分，研究人员首先比较了野生型SpCas9和SpRY在DNA底物上的20个不同目标位置上用不同的PAM基序产生双链断裂的能力。在20个引导rna的情况下，野生型SpCas9可以消化其中的4个位点，而SpRY可以消化其中的19个位点。
此外，他们还比较了野生型SpCas9、SpRY和SpG的活性，SpG是SpCas9的变体，旨在靶向某些PAMs，使用64个额外的gRNAs靶向一系列位点。他们的发现强调了野生型SpCas9对NGG PAMs的偏好，而SpG对NGN的偏好。与此同时，SpRY可以消化64个站点中的59个，接近完成，这表明它确实几乎没有pam。
SpRYgests可以用于一系列应用程序。例如，它们可以在分子克隆中与等温组装方法一起使用，例如当质粒的部分被交换时。根据kleinver的说法，他们可以简化和提高方法的精度，因为SpRYgests允许在gRNA指定的任何点进行DNA切割，而不必确定附近的限制性内切酶靶位点。同样地，SpRYgests可以用于生成饱和突变库，从下一代测序库中耗尽不需要的序列，并在测序协议中进行目标富集，正如研究人员在他们的论文中指出的那样。
为了使SpRYgests得到更广泛的应用，研究人员还对SpRY蛋白纯化gRNA合成协议进行了改进。特别是，他们结合了模板和在体外并将IVT反应时间缩短至4小时以下。研究人员指出，这种一锅gRNA合成方法减少了操作时间，降低了成本，并使SpRYgest的工作流程更类似于其他分子克隆方法。
kleinver指出，这些优化应该使SpRYgest“易于实现”。
他补充说，完整的方法包含在论文中。他说:“寡核苷酸可以从供应商那里购买，gRNA转录试剂盒已经上市，我们希望不久蛋白质也能从供应商那里获得(但与此同时，我们已经提供了纯化SpRY酶的细节)。”“我们希望这种方法的简单性将允许用户将SpRYgests合并到他们典型的分子克隆工作流程中，而不会有太多的挑战。”