随着CRISPR研究人员开发出新的更好的方法来编辑基因组，同时尽可能少地留下意想不到的后果，由加州大学旧金山分校和麻省理工学院的科学家领导的一个团队开发出了一种方法，可以创建完全可逆的基因编辑。
在最近的一项研究细胞UCSF的Luke Gilbert, MIT的Jonathan Weissman和他们的同事描述了他们的方法，称为CRISPRoff——一种可编程的表观基因组编辑器，由单个死Cas9融合蛋白组成，可建立DNA甲基化和抑制性组蛋白修饰。这种短暂的crisprof表达启动了基因和DNA甲基化的高度特异性抑制，这是通过细胞分裂和干细胞向神经元分化来维持的。在他们的实验中，他们发现表观基因组编辑是高度特异性的，只有最小的脱靶编辑。
为了逆转这一效应，研究人员随后设计了一个他们称为CRISPRon的开关，通过这个开关，他们使用cas9介导的基因编辑来灭活DNMT1——哺乳动物细胞中主要的DNA甲基化维持酶——在他们之前沉默特定基因的细胞中。在dnmt1敲除后，60%到80%的细胞表现出重新激活的基因表达。类似地，用DNMT1小分子抑制剂处理细胞显示先前沉默的基因重新激活表达，表明DNA甲基化的耗尽足以逆转crisproff介导的基因沉默。
“如果你想修复致病性突变，那么CRISPR确实是可行的。但我们认为，对于许多应用来说，你可能不想永久地突变基因组，”吉尔伯特在解释该方法的起源时说。“所以，我们正在寻找一种方法来关闭或打开基因表达，而不需要操纵基因组序列，只需要操纵细胞产生的转录本。”
他指出，在医学上，可能有许多应用，如果患者知道他们的基因不会被永久改变，他们可能会更愿意使用基因组编辑，部分原因是基因疗法已经在各种应用中使用了十多年。
Gilbert进一步指出，虽然他、Weissman和许多其他CRISPR研究人员一直在使用CRISPR干扰(CRISPRi)等工具，这些工具可以下调基因表达，而不是完全关闭基因表达，但从治疗的角度来看，这些工具更难以使用。常规的CRISPR-Cas系统使用Cas核酸酶锁定基因并以某种方式使其突变从而关闭基因，而CRISPRi使用失活的Cas9，从而导致rna定向的靶区域转录控制。换句话说，它的功能“几乎就像细胞内的正常转录因子一样，在细胞中，你构成性地表达蛋白质来靶向基因，然后打开或关闭基因，”吉尔伯特解释道。“Cas9的优点之一是你可以简单地表达它，它会对基因组进行永久性的改变，并在很长一段时间内进行。我们一直在寻找方法，从根本上利用Cas9的持久性和持久性的优势，但也利用这种表观遗传编辑功能，不必永久性地突变基因。”
Weissman补充说，死亡的Cas9作为一个可编程的DNA结合元件工作，而不是作为一个可编程的核酸酶。
研究人员认为，就人类的治疗应用而言，这项技术有很多可能的用途。vwin德赢ac米兰合作例如，在埃博拉疫苗出现之前，他们正在研究CRISPRoff，作为一种为任何可能受到这种疾病影响的人提供可编程免疫的方法。
吉尔伯特说:“如果你有一种病毒，你知道它的受体，你可以使用crisprof关闭基因表达。”对于埃博拉病毒来说，这种受体是一种叫做NPC1的蛋白质。“我们知道，如果你关闭肝脏中的NPC1，你就会对埃博拉病毒免疫。但你不想永久性地突变NPC1，因为你会导致胆固醇处理缺陷和溶酶体储存障碍表型，”他补充说。因此，他们的想法是将CRISPRoff传递到前往埃博拉病毒热点地区的医护人员的肝脏中，这样他们在与患者共事时就能完全免疫这种疾病。
吉尔伯特补充说:“当它们离开埃博拉热点地区时，为了避免突变或永久沉默NPC1的有害影响，然后你可以重新传递CRISPRon来恢复基因表达，因此不会因为永久失去基因功能而产生任何有害的表型。”
他进一步指出，这项技术甚至可以用来调节疼痛反应。vwin德赢ac米兰合作如果有人打算做手术，或者从受伤中恢复，CRISPRoff可以在短时间内关闭疼痛感受器。一旦病人康复，痛觉感受器就可以重新打开。它还将帮助人们避免服用阿片类止痛药。
韦斯曼说，另一个例子是在肿瘤学领域。癌症研究经常揭示基因或基因突变的存在，导致对化疗或放疗的耐药性。CRISPR现在被认为是一些晚期癌症患者治疗的一种可能的补充，作为一种敲除耐药基因并重新唤醒治疗反应的方法。
2019年5月，克里斯蒂安娜医疗保健公司(Christiana Care)的基因编辑研究所准备向美国食品和药物管理局(fda)提交一项临床试验方案的研究性新药申请会使用CRISPR基因组编辑来提高化疗的疗效吗kras阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者。该方案涉及使用CRISPR-Cas9基因编辑敲除NRF2，以使患者对化疗药物更敏感。
在使用CRISPRoff的情况下，该基因的表达可能只在进行必要的癌症治疗时关闭。“你可以想象打开或关闭肠道或血液干细胞中的基因，”韦斯曼说。“这些细胞对辐射更敏感。但在你接受放射治疗后，(细胞可以恢复)正常状态，所以你不必担心关闭基因的长期后果。”
韦斯曼指出，在某些情况下，可能不需要CRISPRon来重新启动基因表达。在进行实验时，研究人员注意到某些位点的基因沉默会在几天或几周内衰减，这取决于细胞周期的周转率。
韦斯曼说:“如果可以调整，我们现在就可以采用一种治疗方法，经过几周或几个月的时间，它就会自然恢复，而不必采用第二种治疗方法。”
衰减的速度将取决于相关组织，而组织更替的动态“将决定这些程序的变化持续多久，”吉尔伯特补充说。“在肌肉或神经元等有丝分裂后细胞中，这些非复制细胞中的甲基标记可能会持续多年。所以，这取决于细胞类型。”
CRISPRoff在应用于临床之前，仍有许多元素需要研究和完善。吉尔伯特说，与任何用于治疗的CRISPR系统一样，在正确的时间将其输送到正确的细胞中是目前的主要挑战。Weissman补充说，研究人员还致力于使crisprof复合体更小，并能够同时针对多个位点。
但他说，人们已经对这项技术的商业化产生了明显的兴趣。vwin德赢ac米兰合作他和吉尔伯特以及其他几位撰写这篇论文的研究人员都已经申请了crisprof和CRISPRon的专利。
事实上，Weissman说，这项技术可以应用于细胞治疗vwin德赢ac米兰合作，甚至可以帮助开发所谓的现成的异基因CAR-T细胞。目前制造CAR - t的过程既昂贵又耗时，因为它涉及到获取个体细胞，改造它们，并重新将它们作为一种治疗。到目前为止，同种异体CAR -t可能导致危及生命的移植物抗宿主病，并可能被宿主免疫系统排斥。
然而，利用crisprof, Weissman设想能够编辑异基因CAR - t，使其不受个人免疫系统的影响，同时还增加了安全控制，允许医生在需要时关闭CAR - t。他说:“这可能使它成为一种更容易获得的治疗方法。”“你可以有一种更安全、更通用的细胞疗法，然后你可以做更复杂的工程，因为你只需要为许多病人做一次，而不是试图以定制的方式为每个病人做这种复杂的工程。”
总的来说，他补充说，这项研究真正表明的是切割DNA然后修复它是相当困难的。虽然研究人员在避免脱靶效应方面做得更好，所谓的“脱靶”——脱靶编辑的意外后果——比如DNA损伤反应、大的indel、甚至还有嗜色菌病，仍然会对基因组造成损害。
韦斯曼说:“所以，当你不需要这样做时，在治疗上有很多优势。”“像碱基编辑器和主编辑器这样的东西就是这样的例子，我们认为CRISPRoff是它的补充，它允许你从头到尾进行表观基因组编辑，并且以一种干净和可控的方式进行。”