纽约(基因组网)——通过将核苷酸翻转酶与Cas9融合，哈佛大学的科学家们开发出了一种新的方法，可以在不产生双链断裂的情况下编辑点突变。虽然目前它所能进行的碱基转换有限，但该技术可以减少基因编辑中不需要的索引的影响，并可用于纠正与遗传疾病相关的突变。
在第一作者Alexis Komor和资深作者David Liu的带领下，研究人员今天在《科学》杂志上发表了他们的研究结果自然．
“大多数已知的与疾病相关的人类基因变异都是点突变，”刘告诉基因组网。“但目前的基因组编辑突变更擅长引入indels和破坏基因组，而不是特别擅长点突变。”
“在与治疗相关的条件下，纠正点突变的效率和清洁度是适度的，”他说。
这项新研究显示了在细胞中进行更精确的单核苷酸编辑的潜力。将胞苷脱氨酶融合到核酸酶缺失的Cas9 (dCas9)中，研究人员能够将胱氨酸改变为尿嘧啶，本质上是对“C”到“T”的编辑。然后，通过利用细胞的DNA修复反应，他们也能够将鸟嘌呤变成腺嘌呤。
这项技术vwin德赢ac米兰合作还远远不够先进。虽然它限制了indels并支持点突变，但它纠正实际突变的效率在百分比上只有个位数，而且科学家们只能证明12种可能的碱基替换中的两种。尽管如此，刘说它为人类疾病的研究提供了一个机会。
“即使碱基编辑器只能完成六分之一的可能变化，仍然有许多与疾病相关的突变符合这个范围，”他说。
蛋白质融合是从细胞的奇思怪想中夺取对基因编辑过程更多控制权的最新尝试。虽然在减少Cas9酶的脱靶效应方面取得了重大进展，但基因编辑几乎完全依赖于切割DNA。
通常，细胞的主要反应是快速和肮脏的非同源端连接修复，其中包含随机索引以创建敲除。刘说，还有另一种修复途径可以结合个人选择的基因组模板，即同源定向修复(HDR)，“但很少会结合供体模板。”
科学家发现提高HDR效率的方法，但这远远不能保证人们想要看到的插入内容会被纳入到应该去的地方。“这种情况让我的同事(哈佛医学院教授)乔治·丘奇(George Church)注意到，‘许多被称为基因组编辑的行为实际上应该被称为基因组破坏行为，’”刘说。
为了获得更高的编辑精度，刘的实验室寻找了一种避免双链断裂的方法，并直接催化一个碱基转化为另一个碱基。
早些时候，科学家们想到了将胞嘧啶脱氨酶与dCas9结合，以催化胞嘧啶向尿嘧啶的转化，但他们也预测了两种并发症。
首先，它将失去使CRISPR/Cas9如此有用的特异性。Liu说:“如果你简单地将酶拴在一起，这种融合可以在Cas9结合位点附近的几十个DNA碱基上起作用。”他指出，最近发表的一篇论文说明了这个问题，其中拴在dCas9上的DNA甲基转移酶会在35个碱基对窗口中甲基化碱基。
为了克服这个问题，刘的实验室研究了只对单链DNA起作用的胞苷脱氨酶。当cas9引导RNA复合物与它的基因组目标结合时，它会解开一部分DNA。虽然大部分非目标链固定在Cas9酶上，但在PAM识别位点附近的非目标链上有一小部分没有固定，大约有11个碱基对长。
因为它是DNA中唯一可用于蛋白质融合的单链部分，酶的作用仅限于这一部分。“我们的想法是在单链DNA泡内进行直接化学手术，”刘说。“这样一来，它就不会只是编辑几十个DNA碱基，而这将成为一个不那么有用的编辑器。”
刘的团队假设胞苷脱氨酶可以在这个窗口中工作。通过修改酶连接子的长度，他们能够将胞嘧啶脱氨酶的窗口限制在距离Cas9结合位点约3到6个碱基的范围内。
对这种方法的另一个担忧是效率低下。刘说，将dcas9 -胞苷脱氨酶融合到细胞中导致效率降低了10倍。“DNA修复反应会对抗你刚刚做出的改变，”特别是尿嘧啶和鸟嘌呤的不匹配。
Liu的实验室还使用Cas9融合来操纵细胞的碱基切除修复和错配修复途径，将其转化为额外的奖励。为此，他们将尿嘧啶糖化酶抑制剂与针对未编辑链的Cas9切割酶融合，这有助于修复机制倾向于切除鸟嘌呤，用腺嘌呤代替它。
C到T和G到A只是两种可能的变化，但它们为有兴趣研究疾病的人打开了一个可能性的世界。“只要有这两个(碱基变化)，我们就可以逆转细胞中与疾病相关的突变，并对其进行研究，有助于为潜在的未来人类疗法铺平道路，”刘说。
在这篇论文中，研究人员逆转了a与阿尔茨海默病相关的APOE4突变还有心血管疾病，以及p53基因突变，这与几种癌症密切相关。
“根据遗传疾病的标准，有数百到数千种C到T或G到A可以消除突变，”刘说。
刘的下一步是找到诱导其他碱基取代的方法。他的实验室正在探索酶和化学催化剂。到目前为止，刘对自己的进步很满意。
他说:“我们正在开发其他碱基编辑器，但现在描述它们还为时过早。”