巴尔的摩——由哈佛医学院的一个团队领导的研究人员在人类细胞的全基因组编码上迈出了一步，证明人类琥珀停止密码子TAG可以在一次实验中同时编辑几十个基因。
在上个月发表的一项概念验证研究中自然通讯哈佛医学院遗传学家乔治·丘奇(George Church)领导的研究人员通过一次转染，转化了人类细胞系中33个基本基因的TAG停止密码子，标志着首次大规模的人类基因组重编码。
该研究的通讯作者之一、Church实验室的前博士后研究员Eriona Hysolli说，这篇论文“突破了”人类基因组碱基编辑可以同时针对多少个不同的位点的“极限”。
据Hysolli说，这项研究花费了5年多的时间，是与中国科学院的研究人员合作进行的，是建立在Church团队之前的成就之上的，该团队在整个系统中用UAA替换了所有的UAG停止密码子大肠杆菌基因组。希索利现在是巨型生物科学公司(Colossal Biosciences)的生物科学主管，他说，为了将编码扩展到人类基因组，该团队必须克服大量的技术障碍。
她说，首先，与相对紧凑的细菌基因组相比，哺乳动物的基因组通常要大得多、复杂得多。除了拥有更多的基因，它们也倾向于隐藏大量的基因间区，使基因之间的距离很远。此外，由于许多基因组编辑工具都适应于在原核生物中工作，它们通常不能有效地发挥作用，或者还不能用于哺乳动物细胞。
同时处理多个基因的多重碱基编辑也存在障碍。这些方法包括使基因组中不同的目标位点可访问，有效地将含有多个导向rna (gRNAs)的更大负载交付到细胞中，以及减少编辑工具的脱靶混乱。
为了探索在人类细胞中进行全基因组编码的可行性，研究人员研究了TAG停止密码子，它代表较少的靶标，因为它是最不常用的人类密码子，理论上可以通过胞嘧啶碱基编辑器编辑为TAA。
为了应对人类基因组的规模，该团队开发了一款基于python的软件，名为基因组编码信息工具箱(GRIT)，它可以自动进行编码部分的设计过程。
基于人类基因组参考GRCh38。p13和在线基因重要性(OGEE)数据库，GRIT在研究中使用的HEK293T细胞系中共识别了6700个TAG密码子，其中6,648个可通过碱基编辑器在人类单倍体基因组中编辑。此外，该软件还发现了1947个位于基本基因中的TAG密码子，其中1937个是可编辑的。
由于从TAG到TAA的多重编辑需要同时将多个gRNA和碱基编辑器蛋白传递到单个哺乳动物细胞中，研究人员设计并合成了人工DNA片段，或所谓的gblock，每个片段可以携带五个单独的gRNA磁带，并在引入哺乳动物细胞时保持稳定。
在优化了多路碱基编辑策略后，研究人员表明，他们能够通过一次转染成功地将47个靶位点中的33个TAG密码子一次性转化为TAA。
为了评估编码的靶上和靶外效率，研究小组对高度修饰的克隆进行了全基因组测序，并将结果与阴性对照进行了比较。虽然这项研究中的脱靶效应“绝对显著”，但大多数脱靶效应都是在编码区域之外发现的，Hysolli说。
英国纽卡斯尔大学威康线粒体研究中心的基因组编辑专家Magomet Aushev称这项研究“非常令人印象深刻”，他说这篇论文为其他希望实现多重基因编辑的研究人员奠定了基础。
“CRISPR给基因组编辑带来的一件很酷的事情就是多路复用，”他说，并补充说，与以前的工作不同，主要是利用CRISPR修改基因组中的重复序列，这项研究使用不同的引导rna针对不同的基因，这“真的很酷”。
所有的UAG停止密码子都换成了UAA, Church小组之前设计的大肠杆菌通过消耗释放因子1 (RF1)来抵抗某些噬菌体，RF1负责终止UAG和UAA的转译。
类似地，哈佛大学的研究人员和他们的合作者设想，通过将TAG终止密码子转换到TAA全基因组范围内，并用工程eRF1变体取代内源性真核释放因子1 (eRF1)，他们可能能够产生抗病毒的人类细胞系——这是该研究的目标基因组Project-write (GP-write)项目该计划是由丘奇和其他几位研究人员共同发起的人类基因组计划。
Aushev说，虽然最近发表的论文是“一个非常好的初步研究”，它测试了科学家利用当前人类基因组编码技术能走多远，但在通过全基因组编码实现抗病毒人类细胞系方面，仍有巨大的知识缺口需要填补。vwin德赢ac米兰合作
“碱基编辑就像修理轮胎，而基因组工程就像制造一辆完整的汽车，”他说。“也许一项旨在修复vwin德赢ac米兰合作轮胎的技术并不是最好的方法。也许在基因组工程方面需要一些创新，以开发一些更有雄心的新技术。”
奥舍夫指出，除了技术上的挑战，科学家们还不知道人类全基因组重新编码可能产生的副作用。“可能什么都没发生，也可能发生了不好的事情。这很难说，因为从来没有人这样做过。”
与Aushev的观点一致，Hysolli还认为，在科学家将人类基因组编码应用于细胞疗法的制造或防病毒疗法的生产等应用之前，还有很长的路要走。
与此同时，Hysolli表示，科学家可以研究几种潜在的策略，以帮助提高TAG转换的效率和多路复用能力。这些包括继续开发新的碱基编辑器，以提高编辑效率，同时最小化脱靶效应，提高引导RNA传递能力，以及设计新的传递机制以实现更高效的转染。
Hysolli说:“在哺乳动物基因组方面的研究总是更具挑战性。”“我们刚刚为如何实现这项工作打下了基础。”