纽约——研究人员已经开发了一种基于crispr的系统，该系统使用Cas13酶，能够以系统和精确的方式敲打斑马鱼胚胎中的母基因和合子mRNA，以便能够再现发育表型并询问胚胎中的基因功能。
周五发表的一篇论文细胞发育一个国际研究团队说，尽管母体基因对建立早期发育计划至关重要，但由于缺乏对它们进行系统破坏和评估的现有技术，对它们在胚胎中的功能的研究一直具有挑战性。CRISPR-Cas13平台已被用于降解酵母、植物和哺乳动物细胞系中的RNA，但尚未在动物系统中进行系统研究。
在他们的研究中，研究人员开发了一个使用Cas13同源基因RfxCas13d的平台，作为一个有效和精确的系统来耗尽斑马鱼胚胎中的特定mRNA转录本，并使用它来靶向合子表达和母系提供的转录本，导致转录水平平均下降76%和众所周知的胚胎表型再现。他们还证明了该系统可以用于梅达卡鱼、鳉鱼和小鼠胚胎。
斯托尔斯医学研究所助理研究员、合著者Ariel Bazzini在一份声明中说:“这项研究令人兴奋的地方不只是我们的发现，还有我们能做的事情。”“我们仍然不明白基因是如何启动发育的最早阶段的。现在我们可以通过逐个定位它们的RNA信息来找到答案。……母亲(对胚胎)的贡献是我们许多人想要解决的一个谜。”
通过使用Cas13而不是Cas9，研究人员开发了一个针对RNA而不是DNA的平台。通过以一种相对可调的方式直接操纵RNA活性，他们可以研究转录水平的细微变化如何影响生物过程。此外，通过减少但不是完全消除基因活性，他们可以揭示因功能丧失致死而可能被隐藏的表型。以RNA为靶标的治疗方法也比以DNA为靶标的治疗方法更有优势，因为它们提供了暂时的修改，而不会产生永久性的遗传变化。
研究人员首先测试了4个Cas13同源基因。将每个Cas13变体的mRNA单独注射到单细胞斑马鱼胚胎中，他们发现RfxCas13d有效地破坏了母基因和合子基因的功能，没有胚胎毒性，在斑马鱼胚胎中具有特异性。值得注意的是，Cas13d蛋白注射加速了母体RNA耗尽，从而提供了更多的外显表型。
为了确定CRISPR-RfxCas13d系统是否可以用于靶向母系沉积的mRNA，研究人员注射了来自转基因母系的斑马鱼胚胎，该胚胎在RfxCas13d mRNA (mCas13d)、gfp mRNA和三个靶向rfp的导向rna (gRNA)中表达了非常高水平的rfp mRNA。研究人员发现，与单独注射mCas13d或gRNAs，或与不相关gRNAs共注射mCas13d的胚胎相比，荧光强度明显降低。此外，与单独注射mCas13d的胚胎相比，rfp mRNA水平降低了约4.4倍。
重要的是，研究人员说，在mCas13d和靶向rfp mRNA的gRNAs共注射的胚胎中，rfp是最显著下调的转录本，这表明CRISPR-RfxCas13d系统可以在斑马鱼胚胎早期发育过程中以特定的方式在功能上破坏母体提供的mRNA的活性。
接下来，他们开始评估斑马鱼胚胎中母系提供的和/或合子表达的mrna靶向基因敲除的有效性和特异性。为了评估内源性基因敲除后的转录组效应，研究人员以szrd1 mRNA为靶点。他们发现，与单独注射mCas13d的胚胎相比，注射CRISPR-RfxCas13d平台的胚胎中szrd1 mRNA的表达水平降低了7倍，并且没有看到其他实质性的mRNA变化。
他们还测试了CRISPR-RfxCas13d方法对内源性mrna的作用，这些mrna在胚胎发育中扮演着已知的角色，并且先前描述了功能丧失表型。例如，研究人员以dnd1 mRNA为目标，它的损伤会破坏原始生殖细胞的迁移和存活。共注射mCas13d和三个靶向dnd1的gRNAs的胚胎没有检测到生殖细胞，这表明失去了生殖细胞特异性GFP表达。相比之下，单独注射mCas13d或与靶向非相关mRNA的gRNAs联合注射对生殖细胞没有明显影响。
研究人员说，总的来说，这些结果表明，CRISPR-RfxCas13d系统是特异性的。进一步的实验还表明，CRISPR-RfxCas13d有效地诱导了母源和合子mRNA的敲除，再现了斑马鱼胚胎早期胚胎发生表型，并与最小的毒性、脱靶和应激或免疫反应激活相关。
Bazzini在他的声明中指出:“我们认为这个工具可以对我们对不孕不育和发育问题的理解产生深远的影响。”
作者还得出结论，该研究中描述的技术可以作为实现其他CRISPR-Cas13应用的起点在活的有机体内，如RNA编辑、转录追踪和优化的哺乳动物细胞成像。