芝加哥——以色列遗传学家和生物信息学家开发了一种新的计算方法，他们说这种方法在检测CRISPR-Cas9基因组编辑中的脱靶活动方面优于早期的工具。研究人员表vwin德赢ac米兰合作示，这项被称为CRISPector的技术可以发现潜在的脱靶修改，并防止易位，增加了基因编辑的信心。
由巴伊兰大学CRISPR-Cas9研究员亚尔·亨德尔(Ayal Hendel)和以色列理工学院阿拉兹计算机科学学院跨学科中心的计算机科学家佐哈尔·雅基尼(Zohar Yakhini)领导的这些科学家在一篇最新发表的论文中描述了他们的软件vwin德赢ac米兰合作纸在自然通讯．
根据这篇论文，该软件工具可以以低至0.1%的速度识别脱靶事件，这使其有可能显著提高基因组编辑测量的准确性，并使基因组编辑在生物技术和治疗应用中更广泛地使用，作者指出。vwin德赢ac米兰合作
亨德尔说，CRISPR的缺点在遗传学领域是众所周知的。
一个障碍是缺乏准确性，这可能很难检测到，因为下一代测序过程本身的错误往往发生在双链断裂附近，产生的噪声妨碍了生物信息学软件区分NGS错误和基因组编辑的能力。“你需要识别噪音之外的信号，”亨德尔说。
作者指出，另一个潜在的陷阱是在错误的位置切割基因组，导致双链断裂，导致易位，进而可能导致包括癌症和不孕不育在内的疾病。亨德尔说，目前鉴定易位的方法可能很笨拙。
他解释说:“我们希望采用人们目前正在使用的方法来识别脱靶活动，并使用相同的数据来识别易位，这是人们以前无法发现的。”
在自然通讯论文中，研究人员表示，目前分析脱轨活动的算法无法量化这种活动，不能完全擅长从噪声中分离信号(特别是在编辑率较低的地方)，不能检测易位。他们写道:“crispecector促进了多重pcr比对实验中NGS数据的统计分析，以检测和量化不良易位事件。”
亨德尔说:“我们应用了统计模型，这些模型是通过观察治疗的读数和没有编辑的对照实验中的读数得来的。”“通过应用这些统计方法，你现在几乎可以在处理实验中区分噪声和信号，这真的很重要。”
CRISPector处理来自配对处理组和对照组的试验的indel和易位基因组编辑数据，使用多重PCR和NGS的组合来检测、评估和量化CRISPR编辑。研究人员写道:“因此，CRISPector解决了通过GUIDE-seq等公正的发现方法预先识别的基因组位点的验证、量化和鉴定脱靶活性。”
亨德尔说，该工具不读取整个基因组，而是针对基因组中“容易脱靶活动”的区域。
这发生在不涉及CRISPR编辑的“模拟”控制实验范围内。然后，研究人员将这些模拟实验与实际的基因编辑进行了比较。
在这项研究中，研究人员对226个脱靶位点进行了评估。他们发现HEK293-Cas9细胞系中处理过的RAG1、RAG2和EMX1位点存在易位，然后用Droplet Digital PCR验证易位事件，并对indel进行了三行验证。
亨德尔将CRISPR-Cas9描述为“DNA剪刀”。CRISPR组件将剪刀导航到正确的位置，而Cas9部分实际上完成了切割。CRISPector等质量控制工具会评估CRISPR指南的准确性。
“我们不需要去设计一种新的更精确的CRISPR技术，”亨德尔说。vwin德赢ac米兰合作“我可以用更好的引导RNA取代引导RNA……它可以提供相同的预期的目标上的编辑活动，但现在脱靶活动更低。”
研究人员表示，至少有10种以前开发的生物信息学工具可以估计基因编辑活动率。
亨德尔看到的大多数CRISPR质量控制工具都来自学术背景，甚至少数商业工具也植根于学术界。例如,Cardea生物该研究所隶属于加州克莱蒙特的凯克研究生学院，是CRISPR-BIND的共同开发者，CRISPR-BIND是一种快速、高灵敏度的工具，用来表征引导RNA和CRISPR-Cas的相互作用。
的自然通讯论文列出了几种现有的识别潜在脱靶位点的方法，包括全基因组，通过测序(GUIDE-seq),环化在体外用测序方法报告卵裂效应(CIRCLE-seq)，通过测序选择性富集和鉴定适配器标记的DNA末端(SITE-seq)，以及发现原位Cas脱靶和测序验证(discovery -seq)。
另一种工具,rhAmpSeq该公司于2019年推出了一款商业产品，可以验证和量化潜在的脱靶位点，作者指出。新名单上的四位作者自然通讯纸代表踊跃参与。
波士顿儿童医院的一个研究小组开发了一种叫做高通量全基因组易位测序的方法。HTGTS)来识别易位。
亨德尔说:“目前的方法……只是从治疗和控制方面提供了一种编辑价值。”这种方法可能会产生假否定。
研究人员表示，CRISPector在四个方面改进了早期的方法:得益于统计模型，提高了治疗与控制的准确性;当初始分析偏离目标时，识别替代切割位点的能力;从多重PCR和NGS数据中检测编辑实验中的不良结构变异和易位;报告疑似脱靶活动的统计置信区间。
作者指出，以往的大多数CRISPR质量控制方法都不适合多重PCR实验解释在一个自然随论文发布的博客文章。虽然CRISPector是为多重PCR环境设计的，但它也可以支持单重PCR。
亨德尔说，开源的CRISPector软件既适用于进行临床前研究的学术实验室，也适用于希望评估CRISPR过程的生物技术公司。它现在可以在Github上免费用于学术用途，他说，该公司正在寻找几种将该技术商业化的选择。vwin德赢ac米兰合作
总部位于爱荷华州Coralville的IDT公司将有关CRISPector商业化的问题转给了亨德尔公司。
该论文的作者表示，更好地理解CRISPR基因编辑中潜在的脱靶活动将有助于遗传学家设计更好的编辑策略。
作者说，巴伊兰大学亨德尔实验室和Technion公司Yakhini研究组的研究人员希望，CRISPector将帮助他们探索治疗免疫系统遗传疾病的新疗法，以及治疗癌症的新免疫疗法。
他们还说，该软件的未来版本将支持使用独特的分子标识符作为多重PCR实验的一部分，以尽量减少扩增相关的偏差。
“CRISPR领域的挑战之一是它会产生不同类型的不良事件，通过应用一种检测方法很难挑选出所有不同类型的不良事件，”亨德尔说。
他的团队在研究多重PCR的同时，也在寻求开发新的检测方法，并使现有的检测方法适应CRISPector统计模型。
“CRISPR正在造成多种类型的损害，”他说。“要真正解决每一个问题，你可能需要一种不同类型的实验，一种分析，来评估它，”亨德尔推测。