美国国家标准与技术研究所的一个研究小组领导的研究人员使用商业公司SeraCare提供的一组液体活检参考材料，发表了一项多中心研究，为此类工具在质量保证和跨平台比较方面的力量提供了新的证据。vwin德赢ac米兰合作
这项研究发表在上周的《科学》杂志上分子诊断杂志，该团队将SeraCare的40种变体产品应用于七个参与实验室的下一代测序分析，目标是评估该商业试剂盒的适用性，以基准多个步骤，包括各种分析中的DNA提取、定量、制备、仪器分析和生物信息学分析。
根据实验室间的结果，该小组得出结论，参考物质确实提供了一个“适当的工具”来确定不同测试的分析参数。作者还强调了从他们的比较中收集到的一些关于测试变异性的见解，包括使用不同方法观察到的DNA提取率的差异以及在低变异等位基因频率下突变检测的一些变化。不过，他们说，总的来说，他们在使用的NGS测试中看到了大致相同的结果，至少在可以直接比较的地方。
液体活检检测出现并进入临床市场的速度，一度超过了参考和质量控制材料的创造，以帮助该领域确保检测的准确性和可比性。但在过去几年里，这方面的努力有所加快，无论是在学术界，还是在商业上，以填补这一空白。
SeraCare多年来一直为液体活检验证和质量检测提供人工样本。该公司曾说过它的参考文献是使用一种独特的技术产生的，这种技术产生的DNA片段大小分布比其他剪切方法vwin德赢ac米兰合作更接近于模拟原生cfDNA。
NIST团队研究中使用的产品集涵盖了28个基因中40个临床相关的癌症变异，每个基因都以三种不同的变异等位基因分数(VAF)添加到野生型DNA的背景中:2%，0.5%，0.125%，以及0%的对照。该研究的作者写道，整个小组包括单核苷酸、插入、缺失和两种结构变异，“选择它们既是为了临床重要性，也是为了挑战下一代测序(NGS)方法的性能”。
NIST生物测定方法、生物系统和生物材料部门的组长Kenneth Cole在一次采访中说，他和他的同事们正在从事各种参考物质的研究，包括对其他商业产品的比较，以及与国家癌症研究所早期检测研究网络合作开发他们自己的参考样品。
“很难与患者样本进行这种集中比较，”他说，以深入研究一项检测的各个方面的性能。“但有了(合成的)参考，我们就可以了，”他解释道。
在他们的研究中，每个参与的实验室——包括来自EDRN的几个实验室，弗雷德里克国家实验室的分子表征实验室，以及其他一些外部志愿者——从SeraCare样本集中提取DNA，并使用他们自己的提取、定量、分析和生物信息学方法，用他们自己的内部方法对其进行表征。
测序方法包括四种采用Archer Reveal ctDNA靶向NGS协议——两种使用Illumina MiSeq仪器，一种使用Hi-Seq，一种使用NextSeq 500。另一个实验室对赛默飞世尔公司的离子激流PGM进行了数字NGS，另一个实验室使用了一种方法叫SiMSen-Seq在MiSeq上，第七个使用了一种叫做Deep -seq(深度误差消除等离子体测序)的技术，也在MiSeq上。
在从比较中收集到的见解中，首先，不同实验室使用的提取方法在产量上存在显著差异。5个实验室使用人工提取方法，其中3个使用了SeraCare用于开发正在研究的参考物质的QIAGEN QIAamp循环核酸试剂盒。两个实验室使用自动化仪器。
例如，作者指出，对于0.125%的VAF样本，实验室C使用自动提取方法与两个手动处理实验室相比具有统计上的不同结果，而同样自动化的实验室D与第三个不同的手动处理实验室相比具有统计上的不同结果。在使用0.5%的样品和使用2%的样品的实验室结果之间也观察到类似的差异。
尽管有限，但作者写道，结果表明“自动化方法与一些手动程序相比，往往具有较低的产量。”然而，比较也能够表明某些协议可以帮助解决这个问题。例如，“在手工方法裂解缓冲液中添加载体RNA似乎有助于提高DNA的回收率，”他们补充说。
总的来说，Cole和他的合著者得出结论，研究中使用的7种NGS分析显示出“良好的相关性”，尽管直接比较的能力受到不同小组包括不同数量目标的限制——从SiMSen-Seq分析的4个目标到数字NGS离子流方法的32个目标。
该小组写道，所有的方法都在0.5%和2%的VAF样本中检测到各自的目标变异。0.125%组和0%组的难度更大。SiMSen-Seq在0.125%的水平上检测到所有四种目标变体。
Digital NGS离子流检测能够在0.125%的样本中检测到32个目标变异中的28个，在0.5%的样本中检测不到APC、ATM、BRAF和PIK3CA变异。
该研究的作者写道，在36个数字NGS变体(主要是单核苷酸重复)中，有4个在VAF 0%参考物质中也产生了假阳性读数，这一限制在内部正常患者样本中得到了体现，并且与Ion Torrent技术的已知限制相一致。vwin德赢ac米兰合作
作者补充说，这些发现说明了参考物质在帮助验证NGS测定和对标不同平台方面的价值。
尽管对生物信息学检测算法进行了调整，但Archer Reveal检测能够在0.125%的样本中检测到23个目标变异。DEEP-Seq还在0.125%的水平上检测到所有7个目标变异。
有趣的是，其中三个使用Archer Reveal ctDNA NGS检测的实验室也在野生型(或0%的样本)中发现了变异。由两个实验室进行的正交ddPCR分析显示了相同的结果，这表明这些“假阳性”可能反映了这些变体实际上存在于用于构建SeraCare产品的背景DNA中，而不是反映了检测或使用的信息方法中的错误。
在一封电子邮件中，SeraCare写道，其ctDNA阳性和野生型参考标准中使用的GM24385背景DNA已被很好地描述和广泛研究。因此，当这些材料用于其主要目的时，即作为阳性敏感性控制以确定检测特定变体的能力，而不是作为阴性控制时，它包含可能被某些测定方案检测到的整个基因组的变体这一事实不应成为问题。该公司在其产品的包装插入中包含有关这方面的相关信息。
Cole补充说，比较中另一个有趣的发现是，尽管数字PCR越来越多地被用作验证NGS液体活检结果的一种金标准，但它的准确性并不是铁的，似乎取决于如何设计分析。
他说:“SeraCare对几乎所有的变异都使用了数字PCR，我们对大约9种变异进行了检测，我们发现了一些差异，这是因为我们设计的检测方法不同。”
根据Cole的说法，他在NIST的团队也希望很快从他们正在进行的研究多种液体活检参考产品的大型研究中得到结果。通过EDRN，该团队希望能够很好地描述这些商业产品的特性，并开发新的参考材料，以帮助确保现在即将出现的新一代癌症早期检测分析可以自信地验证和监测质量。