纽约- 2019冠状病毒病大流行两个月以来，美国各地的SARS-CoV-2分子诊断检测数量仍然严重不足。
根据新冠肺炎疫情跟踪项目这是一个追踪全国检测的志愿者组织，由大西洋截至周一，美国共进行了400多万次冠状病毒检测，过去几周每天约进行15万次检测。专家表示，这远远不足以充分追踪新感染病例，而逐步取消居家令和对公共生活和企业的其他限制则需要追踪新感染病例。
尽管持续的检测短缺有很多原因，但其中一个挑战是试剂短缺，特别是RNA提取试剂盒。此外，许多SARS-CoV-2检测很难在高吞吐量下进行，从而真正提高检测数量。
这种试剂盒短缺可能不会影响销售全自动系统的供应商，如罗氏、Cepheid、Hologic、雅培或GenMark的检测，但它们确实适用于全国几十家开发了自己的检测方法或运行疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)检测方法的实验室。
为了缓解这一瓶颈，几个实验室和至少一家公司一直在研究直接将样本添加到PCR反应中，而不需要耗时的RNA提取的方法。
例如，佛蒙特大学医学院的一个研究小组和他们在华盛顿大学的合作者，发表一个BioRxiv本月预印本-更新早期版本他们在3月发表的文章中描述了一种不含rna提取的SARS-CoV-2测试。通过对155个已知阳性的鼻咽样本进行验证，他们发现它能正确识别其中92%的样本。
佛蒙特州免疫和传染病中心的副教授、该研究的共同通讯作者杰森·博腾表示，他的病毒学研究实验室从未想过要进入COVID-19 PCR诊断领域，但为了帮助佛蒙特州缺乏RNA提取试剂盒的实验室，他跳进了这一领域。该研究目前正在一家杂志上接受审查。
他的实验室在3月初得知Qiagen病毒RNA提取试剂盒严重短缺，最初着手确定是否还可以使用另一种类型的Qiagen病毒RNA提取试剂盒。“在讨论中，我们中的一些人说，‘如果我们只排除提取步骤呢?’，”他回忆道。这样做不仅可以消除试剂盒短缺，还可以加快检测速度。他说:“这个提取步骤是整个试验中限制最大的步骤。”“进行提取比进行下游PCR需要更多的时间。”
在不到一周的时间里，他的团队设计了一种无RNA提取的检测方法，在来自阳性患者的两个NP样本上进行了测试，以证明它是有效的，并将结果作为预印本发布。在对更多的样本进行了测试后，他的团队与在华盛顿大学运营一个临床测试实验室的Keith Jerome合作，用150个来自高、中、低病毒载量患者的额外样本验证了该方法。他们发现，该测试遗漏的唯一样本的病毒水平较低，而在华盛顿大学检测呈阳性的所有样本中，约有四分之一属于这一类。
与此同时，至少还有另外两个组织，总部设在智利而且丹麦的研究都独立报告了类似的无rna提取方案，其中一项研究表明，它也适用于鼻腔拭子。他说:“似乎各地的人们都在使用这个软件。”
Botten说，他可以想象这种不需要rna提取的检测方法被用作一种筛查工具，可以在节省时间和劳动力的同时提取出绝大多数病毒阳性的人，而且不需要提取试剂盒。他补充说，那些检测结果为阴性但被怀疑患有这种疾病的人需要用一种使用RNA提取的检测方法重新进行检测。
他说，佛蒙特州的测试实验室最终没有采用他的方案，因为他们能够开始使用大型自动化系统，从而获得足够的试剂包。同样，UW的合作者还没有看到采用这种化验方法的必要性。
然而，作为对预印本的回应，Botten收到了来自世界各地实验室的数十封电子邮件，称他们无法开始测试，因为缺乏RNA提取试剂盒。博腾说:“我认为，这一技术的真正好处可能是在世界上所有无法使用这些试剂盒或无法使用这些真正高通量的自动化机器进行测试的地区。”
他说:“你会想要尽可能多的大型、自动化、强大的在线系统，但这只能覆盖一定数量的(实验室)。”“对于其他所有人，可能是大多数人，你将需要一些尽可能简单的东西，以便消除所有这些限制，人们可以快速测试。”
他说，该检测方法还可以进一步优化，以提高其灵敏度，例如使用更少的棉签培养基，这将增加样品中病毒颗粒的浓度。
威斯康辛医学院微生物实验室医学主任内森·莱德布尔(Nathan Ledeboer)也认为，RNA提取“对进行新冠病毒检测的临床实验室来说是一项重大挑战”，至少对那些进行自己实验室开发的检测或美国疾病控制与预防中心(CDC)检测而不是全自动系统的实验室来说是这样。
他自己的实验室从CDC试验开始，最初无法从BioMérieux和赛默飞世尔科学公司获得用于其两个提取系统的RNA提取试剂。他说，全国各地的其他实验室也有同样的经历。
他说:“事实上，在这项特别的研究中，他们能够证明一个非常高的敏感性，而不需要进行提取，这是一个非常有前途的替代方法，特别是在那些试剂非常、非常有限的情况下。”
虽然随着时间的推移，提取工具的短缺有所改善，但仍需要测试更多的人，“随着我们开始扩大测试能力，我们将看到系统面临更多的压力。”
除了美国疾病控制与预防中心的检测外，他的实验室还采用了罗氏和造父变星平台进行新冠病毒检测，这帮助缓解了一些供应限制。Ledeboer说，虽然越来越多的实验室似乎正在从实验室开发的测试转向商业平台，制造商也在增加产量，但“仍然有巨大的需求，供应商无法完全提供所需的测试数量。”
他说，想要采用无rna提取协议的实验室需要在内部验证它，并将其作为当前紧急使用授权的修改提交给美国食品和药物管理局。
商业努力
与此同时，至少有一家商业公司BioSkryb也开发了一种不含rna提取的SARS-CoV-2检测方法。3月底，该公司在推特上说，它已经创建了“一种更便宜、更快、更安全的COVID-19检测方法，取消了提取步骤”，并补充说，每个样本的成本约为15美元，每次测试可扩大到190个样本。
BioSkryb的首席执行官杰伊·韦斯特解释说，他的公司总部位于北卡罗来纳州，一直在开发全基因组扩增技术vwin德赢ac米兰合作他多年来一直在研究不需要提取核酸的单细胞分析方法，“所以我知道我们可以通过PCR测试来研究这种(病毒)物质。”
他们的目标不仅是开发一种不需要RNA提取的检测方法，而且是一种快速且可复用的检测方法。他的团队提出的测试——使用新英格兰生物实验室、Twist生物科学和集成DNA技术公司的试剂和输入——将鼻咽拭子插入稳定缓冲液中，使病毒失活，但保留病毒RNA。
经过一个简短的加热步骤后，样品被直接加入到PCR反应中。该公司已经能够并行运行184个样本，以及一个阳性对照，测试的周转时间约为2.5小时，韦斯特表示可能会进一步缩短。这项检测是在赛默飞世尔科学QuantStudio 7上开发的，韦斯特说，许多临床实验室都使用这种仪器，但原则上也可以在其他qPCR机器上运行。他说:“我们在两天半内就开发出了测试的基础。”
该公司能够检测到10份病毒RNA，也就是说在样本中只能检测到200份。在初步验证之后，Bioskryb将测试套件运送给田纳西大学的合作者，他们研究活病毒，以评估其特异性。该小组发现，该测试检测到了SARS-CoV-2，但没有检测到导致中东呼吸综合征的冠状病毒。有了这些数据，BioSkryb现在计划向FDA申请紧急使用授权。
它还免费向两家医院实验室提供了试剂盒，用于进一步检测，并可能将其送往其他实验室。韦斯特说:“我们正在接受客户的请求。”“事实是，我们并没有很努力地推销这一点。”
韦斯特说，这些实验室目前正在验证这种检测方法，并可能决定扩大规模。他补充说，如果需要，BioSkryb将能够每周生产数千份检测结果，“没有任何实际负担”。
虽然该公司从未计划进入COVID-19检测业务，但他说:“如果这对客户来说是一种增值，我们肯定会提供这种服务。”“在这样的测试中获得现金收益并不是我们的首要目标。但就围绕我们的核心技术扩展能力而言，这是一个值得尝试的合理应用，并作为一种公共服务提供。”vwin德赢ac米兰合作
展望未来，他说，BioSkryb有兴趣将该检测与其单病毒基因组测序的核心技术结合起来，以确定SARS-CoV-2的克隆多样性。vwin德赢ac米兰合作
与此同时，其他实验室一直在探索缓解冠状病毒检测瓶颈的其他方法。例如，罗格斯大学(Rutgers University)的一个实验室最近开始使用唾液样本作为输入材料，因为它们比NP拭子更容易收集，而且不需要拭子和病毒运输介质，这些也变得稀缺。然而，缺乏时间在他们自己的实验室中验证这些修改可能会阻碍其他人实现这些更新的工作流。
Ledeboer说:“随着第一波疫情开始减缓，我们中的许多人将有时间进行这些研究，并能够开始考虑这样做。”“到目前为止的一个挑战是，临床实验室一直在全速运转，如果你愿意的话，专注于能够提供尽可能多的测试，尽可能广泛的测试。这在很大程度上是由我们检测到的病例数量的迅速增加所导致的。当我们开始看到第一阶段开始放缓和减弱时，我们真的有机会开始这些研究，以精心设计的方式进行，这样我们就可以获得有用的可行数据。”