单细胞生物是研究人员越来越感兴趣的领域，因为越来越多的研究表明，细胞群——即使来自同一器官或组织的细胞群——也不像以前认为的那样同质。
一些研究人员对单细胞水平的基因表达研究特别感兴趣，因为它可以比混合细胞的基因表达研究更好地洞察分子机制。相比于评估一组异质细胞的平均基因表达，量化一个细胞内的转录活性的能力提供了工作中的生物学途径的清晰图像。
Anders Ståhlberg是瑞典哥德堡大学伦德伯格癌症研究实验室的研究员，多年来一直在探索使用逆转录实时定量PCR技术进行单细胞基因表达分析。一个方法概述他和他的同事为这一应用开发的产品目前已在该杂志上发表方法．
PCR内幕最近赶上了Ståhlberg，讨论基于实时pcr的单细胞分析的挑战，以及这种方法的一些关键应用。以下是经过编辑的采访内容。
是什么让你开始研究基于pcr的单细胞表达分析?
我们从正常的基因表达谱开始，就像许多人用微阵列来检查临床样本或生物样本的状态一样。然而，当涉及到诊断时，人们(使用标准基因表达谱)会遇到很多问题，因为当你提取样本时，你会得到相当异质的材料，因此它们会受到不同数量的不需要的细胞类型或不同数量的细胞的污染，等等．当然，这会对你得到的输出产生偏差。
因此，如果你真的能选择你想要观察的细胞，并能找到你感兴趣的细胞，你将从你的研究中获得更多的信息。
所以我们做了很多传统的基因表达测量，在很多情况下我们发现这是不够的。
你的论文指出，单细胞方法仍然没有被广泛采用。为什么会这样呢?
在很长一段时间里，由于技术的限制，这或多或少是不可能做到的。你可以做不同类型的原位例如，杂交，但这需要相当先进的设备和专业的经验，而且你通常一次只能测量几个特征。例如，如果你在蛋白质水平上做单细胞分析，你通常使用某种类型的荧光蛋白，然后你被限制为只有红色，绿色和黄色，这是相当棘手的。
我认为问题还在于人们不理解从单细胞实验中能得到什么样的数据。因为对细胞群进行测量会得到与单细胞测量截然不同的结果。在单细胞测量中，你会得到非常不稳定的数据，因为在一个细胞中，特定基因的mRNA一直在上升和下降。人们通常认为基因表达是特定细胞或特定细胞类型的稳态值，但事实并非如此。我们已经用非常灵敏的方法对特定基因进行了验证。
所以只要知道这个事实，它应该是可变的，你就可以利用这个事实，使它适应实时PCR，并测量许多基因。我们的方法的好处是很容易改变你感兴趣的基因。你也可以做预放大。你可以看看所有的成绩单。我们通常会做大约10个基因，如果我们做预扩增，我们可能会做50个基因或类似的东西。
如果你做某种筛选，微阵列可以很好，然后你可以进行实时PCR。如果你使用微阵列，如果你想做很多单元，它会变得非常昂贵。如果你知道在同一种细胞类型中有这种异质性，那么你可能想要观察至少30、40或50个细胞，然后对于一个样本你要运行50个微阵列，这就变得相当广泛了。然后，如果你有很多要分析的样本，很少有人能做这种实验。
但如果你用我们的方法来做，对许多实验室来说是相当可行的，因为(他们)有设备。问题是你需要知道你在做什么，并真正优化所有不同的步骤——从如何照顾细胞，如何收集细胞，如何裂解细胞，如何对细胞进行逆转录——所有这些不同的步骤你都需要完全控制。所以，把它们放在一起实际上今天做这些测量并不是那么棘手。
您认为标准的实时PCR基因表达方案和单细胞方案之间的关键区别是什么?
[单细胞分析]的主要区别在于，你不能从一开始就进行任何提取，因为你只有很少的转录本。这取决于你有什么类型的细胞，也许你有几十万个转录本，这可能是5个，1万个不同的基因在特定的时间点在特定的细胞类型中被表达。这意味着你能检测到的转录本并不多，所以你不能真正提取和纯化样本。如果你进行正常的净化，就像所有其他正常测量的标准一样，你可能会损失90%的材料。
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我们已经仔细研究过了，实际上我们溶解了细胞。这意味着你必须破坏细胞壁，然后让mRNA可达。重要的是要知道在这一步中你没有任何抑制你真正掌握了所有你感兴趣的转录本。
所以主要的区别实际上是在一开始:你如何照顾细胞，你如何裂解细胞。然后在中间进行反转录和qPCR，这与[标准PCR研究]非常相似，尽管反转录的效率非常重要。当你将mRNA转化为cDNA时，如果效率很低，比如1%，而你有100个转录本，这意味着你只有1个cDNA拷贝，而不是100个。当然，要做一个可靠的量化是非常困难的，所以在所有步骤中都要有高效率是很重要的。
而且，当你测量一个特定的基因时，或多或少所有的基因都应该给出相似的值。细胞中的转录水平总是上下波动，在某个时间点，大多数细胞会有一定数量的转录水平低于你的检测水平，因为不同基因的检测水平不同，一个基因可能有5个拷贝，另一个基因可能有20个拷贝。但是转录本的表达水平可能在0到200个转录本之间变化。这意味着您不应该在您正在分析的所有单细胞中得到结果。你可能应该在80%的单元格中设置值，但是零值并不意味着失败;这只意味着可能有10份或更少的拷贝。
所以你需要知道这些东西。很多人错误地认为发生了某种错误，但这通常不是问题所在。
另一个问题是，人们在传统的基因表达分析中想要做某种归一化，这意味着你想要把你比较的所有样本归一化，传统的归一化通常意味着你把它归一化为一些表达在恒定水平的基因。当然所有的基因都在上升和下降，所以这在单细胞的基础上是不成立的。所以如果不知道这些事情，人们很难从正常的基因表达分析到单细胞测量。他们会遇到各种各样的问题。
对于单细胞分析，除了归一化，还有别的方法吗?
好在你知道你只是在测量一个细胞，所以当你做这类实验时，主要的问题是如何知道你是否把所有的mRNA都从细胞中取出来了。这很难确定。我还没有做过这些实验，但有一种方法是注入已知量的外来mRNA分子，然后在很多细胞中这样做，看看当你溶解它们时是否得到相同的量……但这是没有人做过的事情。这有点棘手。
通常的方法是你知道你有一个单元格。使用传统的[基因表达谱分析]，你可能会提取1万个细胞，然后提取[DNA]，但随后会丢失很多物质，所以你无法再将其与1万个细胞进行比较，因此你只能继续使用这些参考基因[和标准化]。因此你实际得到的值是一个特定单元格的拷贝数。
所以要么你可以提供cDNA分子的绝对数量的数据，这很简单，要么你可以确定RT效率。这需要更多的实验，但这是可以做到的。在这个领域已经做了很多研究，所以知道我们谈论的是多少副本是很好的，而不仅仅是相对的值。当你做正常的基因表达分析时，你得到的是相对值——有些东西是向上或向下的。但这里我们可以说每个细胞有100个拷贝。我们的估计总是一个较低的估计，所以我们知道，如果我们已经确定我们有100个cDNA分子或100个mRNA分子，这意味着我们有这个数字或更多，因为如果我们失去了一些我们不知道的东西，但如果我们有100个，我们知道我们至少有100个。
你认为单细胞基因表达分析的主要应用是什么?
嗯，这是我的研究领域，但……识别癌症干细胞(是一个有前途的领域)。我们知道很多肿瘤都是由癌症干细胞产生的，但是数量非常少，所以如果你能观察单个细胞并识别出这些癌症干细胞，你就能看到它们与其他细胞的不同之处，然后你也可以将其与血液中的循环肿瘤细胞进行比较。
另一件事是干细胞分化。举个例子，如果你想用产生胰岛素的β细胞移植治疗1型糖尿病，当然在很多实验室里你会这样做在体外所以你从未分化的人类胚胎干细胞开始这些诱导多能干细胞，然后你分化它们。但当然不是所有的细胞都会分化，所以观察它们是非常重要的在体外细胞:这些我们想移植的细胞看起来和其他细胞一样吗?我们不想把它们都收获因为你只看它们就知道有些是有分化的，有些不是。因此，它可以作为研究不同类型干细胞分化的表征工具。
所以这是一个非常强大的描述工具。它可以用于病理学，做更精细的诊断。
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这是我正在研究的两个应用程序，但你也可以考虑更一般的用途。例如，几年前我们对胰腺细胞做了一项单细胞研究——产生胰岛素的细胞，β细胞。所以我们取出细胞，用葡萄糖处理它们，然后我们发现并不是你激活了所有的细胞，而是你激活了越来越多的细胞。所以如果你有一个低血糖水平，一些细胞被激活。如果你得到更多的葡萄糖就会激活越来越多的细胞。所以它不是均匀的增加，而是你打开了越来越多的细胞。这对所有不同的器官都很普遍——它们对刺激的反应不同。
并非所有的细胞都是相同的。一些细胞更容易被某些信号激活，而另一些细胞则更容易被其他信号激活，这对于疾病研究非常重要，也对于一般理解是什么引发了身体的不同反应。因为如果不这样做，你只能得到一个粗略的估计——你取整个肝脏，做一个转录剖面，但你不知道是某个特定区域的某个细胞(有反应)，还是所有细胞(都有反应)。这也是一个很有趣的应用领域。
[另一个应用是识别]新的细胞亚型。细胞类型通常由形态学来定义——染色时你有一个是或否。但使用单细胞分析，你实际上可以得到不同[基因]的定量值。我们发现有不同的细胞类型取决于表达的基因水平。这意味着，例如，如果我们观察10个基因，它们在两种细胞类型中都是开启的，但我们可以仅从表达基因的水平来定义两种不同的细胞类型。除了单细胞测量，其他任何方法都无法做到这一点。因为通常你会染色，然后看看记号笔是开着还是关着。所以我认为在这里可以做很多事情。
在单细胞生物学领域有很多研究正在进行。这实际上是一个发展迅速的研究领域。过去，在会议上只有一两个关于单细胞生物学的演讲，但现在有关于单细胞生物学和不同方法的整个会议。
很多人都知道这样做很重要，但一直有很多技术限制，通常他们没有任何设备来做这件事。所以现在，[实时PCR]，你可以使用更多的标准设备，但你只需要知道如何做，以及如何优化所有步骤。
这也使得它更容易被接受用于诊断目的，因为如果你需要非常专业的设备，而没有人拥有，那么在更常规的工作中实施它将是相当困难的。
单细胞PCR目前是用于诊断应用，还是更长期的应用?
我目前正在研究人类肿瘤细胞，但主要是在研究层面。我们正在做的是开始识别癌症干细胞，看看它们从哪里来，它们长什么样，我们还对观察血液中的循环肿瘤细胞感兴趣，看看这些细胞与肿瘤有多相似。我们能找到进入血液的细胞的模式吗?
这些处理循环肿瘤细胞的方法对临床来说非常有趣，因为最近一些商业试剂盒已经被批准，因此它们可以在临床中作为治疗的预后指标。如果你能看到血液中有多少循环肿瘤细胞，这也可以预测病人的结果以及他们可以接受什么样的治疗。我们要做得更深入一些，所以我们实际上想看看这些被识别的细胞，看看它们是什么，它们是如何表现的。我们两者都做在体外我们将细胞移植到小鼠体内，然后我们也将在医院获得临床样本，所以这是最后一步。
您认为这将被用作标准的诊断工具吗?或者它需要比标准PCR工作流程更多的专业知识，这一事实会限制它的采用吗?
我认为它有潜力[被用作诊断工具]，因为正常的基因表达谱在今天的许多诊断实验室中是常规的，所以这真的不需要更多的设备。更多的是专业知识和正确的方法。因此，我认为它会有未来。它究竟是什么样子是一回事，但作为一种研究工具，它已经存在了。对于日常(诊断)工作，它可能也有用处。
当我们学到更多关于如何分类肿瘤的知识时，例如，如果这对我们应该如何治疗病人非常重要，那么当然，如果我们确切地知道我们应该寻找什么，那么进行测量就不会那么困难。如果我们知道要寻找什么，那么做实验就不会那么难了。
另一个好处是你需要很少的样本，所以你不需要做手术。你可以做细针抽吸[或血样]。我可以想象，你可能会抽取一份血液样本，如果它可以预测你应该如何治疗病人，那将是非常有用的，对病人来说不会有创伤。所以我认为在不久的将来，一旦我们对这种异质性有了更多的了解，它会对更精确的诊断非常有用。
你和你在这个领域的工作下一步是什么?
我们已经开始鉴定这些癌症干细胞，所以我们实际上正在筛选这些细胞，并进一步研究它们，看看它们与其他细胞有什么不同。我们有一个不同类型的模型系统，所以我们可以同时使用它在体外在老鼠身上，然后我们也想把它应用到人类身上作为最后一项研究。
我们对正在研究的肿瘤背后的生物学很感兴趣。我们想了解分子机制，所以我们做了很多基础研究。今天我们已经建立了我们想要的所有实验技术，它们都很好，所以我们正处于进行大量实验的阶段。
我们也在做一些平行的项目，我们在不同的器官中鉴定不同的细胞类型，但那是在不同区域的更基本的特征，并确定不同干细胞之间的分化程度等等。
所以实际上有两个部分:一个是了解肿瘤中的癌症干细胞，另一个是不同细胞的基本特征，尤其是干细胞。