研究人员据开发人员称，加州大学欧文分校(University of California, Irvine)的研究人员已经创建了一种微流体液滴阵列，它可以为数字PCR处理100万个单个液滴——比其他数字PCR方法增加了100倍的片上非连续反应体积。
该小组在本月发表在该杂志上的一篇论文中报告说，增加的液滴数量以及其他设计细节——如三维堆叠设计、片上热循环和宽视野荧光成像——意味着克服当前数字PCR技术在动态范围、吞吐量和成像能力方面的限制芯片实验室．
作者在论文中证明，他们的系统可以在2到7分钟内产生超过100万个50皮升的单分散液滴。然后液滴自我组装成一个三维的包装结构，在那里它们可以进行芯片上的PCR扩增和用低成本的2100万像素的数码相机进行荧光检测。
作者报告说，整个PCR过程可以在2到4小时内完成，其中热循环和图像处理各需要1.5小时。
加州大学欧文分校微纳米流体基础研究中心主任亚伯拉罕·李(Abraham Lee)说，他也是这篇论文的资深作者PCR内幕上周，他的团队开始着手实现一个100万滴的设备，最初由贝克曼库尔特公司(现在是丹纳赫公司的一部分)提供输入，该公司在项目启动时是MF3中心的工业成员，但不再直接参与。
他说:“通过(与该公司)的一些讨论，我们发现了一个在微流体方面存在一些挑战的领域，以满足一些聚合酶链反应的需求，这就是数字聚合酶链反应、乳剂聚合酶链反应和高通量实时聚合酶链反应的结合。”
数字PCR需要大量的反应器来增加动态范围，这是由于将样品划分为单分子进行定量所必需的低样品浓度而降低的。他说:“所以我们开始做的一件事就是要有一个大的数字，我们把100万定为一个合理和实际的目标。”
Lee说，虽然Bio-Rad公司的QuantaLife等公司的数字PCR技术可以产生数以百万计的单个反应液滴，但它们不允许成像进行定量实时数据收集。RainDance Technologies也有类似的皮升液滴技术，但还没有商业化的数字PCR产品。vwin德赢ac米兰合作
他说:“他们通常做一个连续的过程，这意味着他们用流动PCR，或者他们用某种方式进行PCR，然后进行检测。”“这意味着在反应之后或反应过程中，你每次只看一个反应堆，所以你会丢失时间信息。”
他说:“人们可以制造100万个液滴，但如果你想用50微升的样品填满一个几平方厘米左右的房间，这是一个商业级别的样品量，[还没有做到]。”
另一方面，Fluidigm公司的数字阵列和Life technologies公司的开放阵列等技术不能划分几乎同样多的独立的反应体积，但可以成像和实时数据收集，Fluidigm公司的营销总监Martin Pieprzyk说PCR内幕上周。
Pieprzyk说:“[加州大学欧文分校]技术的意义在于，他们能否在热循环过程中成像(反应)，从而获得实时数据。”vwin德赢ac米兰合作“但一旦你有了实时数据，它的用处将取决于正在运行的检测和应用的类型。”
Pieprzyk补充说，大多数Fluidigm的客户使用数字阵列进行数字PCR实验——他们只是试图确定单分子的反应量是否被放大了——最终没有使用实时数据，尽管这些数据很容易获得。他说:“目前，很少有数字PCR应用需要实时数据。”
Pieprzyk补充说，加州大学欧文分校的系统是“一项有趣但不是突破性的技术。vwin德赢ac米兰合作主要问题是市场仍在寻找杀手级数字PCR应用。”
在随后的一封电子邮件中，李说PCR内幕能够在数字PCR反应量上进行实时PCR的一个实际好处是能够观察PCR效率。他说:“你可以检查每个分子的热循环过程，并在每次循环后进行检测，因为有了我们的成像平台，随着时间的推移，你可以一次看到所有反应堆。”
液滴叠加
加州大学欧文分校团队的平台设计使用了一个液滴分离器，将一个父液滴分成8次，分成256个“子液滴”。在今年早些时候的一篇论文中，也在芯片实验室该小组讨论了他们的“可调谐”液滴填充方法，该方法通过调整成像室的高度，使液滴在三维空间中排列，而不是只在一层中展开。
“我们发现，你不需要像其他平台那样将它们以二维的方式展开。我们实际上可以堆叠这些液滴，因为它们是半透明的，所以只要你以两层或三层的方式堆叠，你仍然可以通过我们的成像平台来分辨所有液滴的荧光，这是一个非常便宜的，低成本的设置，基本上使用一个商业相机和一个镜头来分辨每个反应堆至少20个像素。”
在最近的一篇论文中，该小组报告说，为了提高能见度，他们在一个11平方厘米的阵列中测试了一种两层的“网格状”排列。作者报告说，这种排列和浓度的成像可以用2100万像素的消费单反相机实现。
“(液滴)堆叠可以让你在相同的2D区域(放置)更多的反应堆。每平方厘米，你可以得到两到三倍多的反应堆成像，因为它们是堆叠起来的。”李说。
作者报告说，对于液滴数量超过100万的液滴，需要更高的像素比，以保持每液滴15到20像素，这是解析每个独立液滴荧光信号所必需的。
该小组通过对反应器液滴进行芯片上PCR热循环来测试该平台，这总共需要65分钟。作者报告说，液滴能够经历40个或更多的循环，合并率低于5%。
作者写道，由于“液滴和PDMS的可变形性”和“实际液滴大小的变化”，他们测试中的点阵取向经常结合了方形包装和六边形包装。这可能会导致数字PCR中确定液滴数量的误差，但他们通过测量阵列图像中的实际液滴大小和密度来弥补这一误差。
根据他们的报告，研究人员对50微升样品中从20到10万个拷贝的各种PCR稀释倍数进行了测试，发现他们的平台测量的总DNA浓度与预测结果非常接近，平均误差不到15%，“这是数字PCR的一个非常有利的性能水平”。
他们写道:“与其他数字PCR研究相比，这个100万液滴的系统使非串行数字PCR反应器数量增加了100倍，并且是第一个在单个微流控设备上集成100万液滴阵列吞吐量和实时成像能力的系统。”
Lee表示，该平台展示了比目前可用的系统更高的动态范围。
“当我们开始并展示我们的平台时，我们被限制在10个5由于一些成像困难，在最好的动态范围内，”李说。“根据我们看到的报告数据，这仍然是最好的。然而，从那时起，其他人将其动态范围的极限推至与端点PCR相似甚至更好的动态范围。因此，我们在论文中没有过分强调动态范围的主张。”
但是，李教授补充说，我们的技术可以将低靶浓度的数字PCR和高靶浓度的实时vwin德赢ac米兰合作PCR结合起来，进一步扩大动态范围。“从理论上讲，端点PCR[有]一个上限，而实时PCR可以继续解决更高浓度，”他说。
此外，他说，“我们在这里没有要求高速度，但这些是小型反应堆，你可以在一定程度上优化它。”“与其他技术(如QuantaLife和RainDance)相比，我们的平台提供了更大的反应器数量，具有实时PCR能力。我们觉得这是一种新颖的互补。”
Lee表示，贝克曼库尔特公司最初对该平台的商业化很感兴趣，但该公司最终从M3中心分离出来。
“即使在最初的合作结束后，我们仍在继续努力，”李说，并补充说，该团队现在“非常满意我们拥有先进的技术。”vwin德赢ac米兰合作
在这一点上，Beckman Coulter仍然有“遥远的兴趣”，据Lee说，尽管他指出，团队也有数字PCR领域的“惯常嫌疑人”，包括RainDance和QuantaLife。
“说实话，我不知道它的商业前景会如何，”李说。“我们拥有IP, Quantalife和RainDance都认为这是一项伟大的技术。vwin德赢ac米兰合作但他们都在忙于自己的技术，所以很难说它将走向何方……但我认为它是有价值的。”
- - - - - -本的救生犬为本文提供了额外的报道。
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