一组研究人员德国的一项研究提出了一组非蛋白质编码rna，可以作为实时PCR数据规范化的稳定内部控制，用于涉及这些分子的研究。
研究人员描述他们的工作在最近一期的核糖核酸他指出，尽管实时qPCR对少量物质中RNA丰度的测量具有敏感性，但“缺乏精确数据分析所需的适当内部控制是其在npcRNA研究中[非蛋白质编码RNA]应用的限制因素。”
虽然在许多PCR研究中，一些蛋白质编码内参基因(或“管家基因”)通常被用作参考，但作者指出，这些分子有其局限性，因为它们的表达水平“因组织和不同的实验条件而异”。此外，在npcRNA研究中使用这些基因作为参考是“有问题的，”他们说，“由于生物成因的差异。”
该团队由马克斯普朗克分子遗传学研究所和Münster大学实验病理研究所的研究人员组成，他们从一组来自不同结构和功能类别的18个rna开始，然后使用实时qPCR来评估它们在20个不同组织中的表达水平。
他们最终列出了11个在所有组织中表现稳定表达的rna。其中，5 - 7SL scRNA、U1 snRNA、5.8S rRNA和U87 scaRNA在所有人类组织中始终表现出最稳定的表达，并且“在这项研究中，表达稳定性明显高于最好的蛋白质编码[管家基因]”。ACTB而且B2M．"
作者建议将5种排名最高的rna中的3种——7SL scRNA、U6 snRNA和U87 scaRNA——包括在“任何给定的npcRNA转录组分析中评估标准化的最小参考候选集”中。
PCR内幕我们采访了马克斯·普朗克研究中心的研究员、这篇论文的合著者Zoltán Konthur，以了解更多关于这些“管家rna”的信息，以及它们如何在未来的研究中使用。以下是经过编辑的采访内容。
是什么让你决定研究管家rna而不是管家基因的使用?
有几个原因。我们参与了一个分析生物信息学预测RNA分子的项目。数据库中有相当多的ESTs与任何蛋白质编码基因都不匹配，所以我们的一位生物信息学同事在人类基因组中偶然发现了这些序列，并认为这可能是一个非常有趣的项目。所以我们参与了这个项目，我们想看看这些[生物信息学预测的rna]是否真的存在。
对人类基因组的预测在15000个转录本的范围内，显然你不能用Northern blot来分析，所以我们认为实时荧光定量PCR可能是一个合适的工具。
我们接下来研究的是什么控制基因或什么内参基因通常用于实时PCR，由于大多数人都在研究蛋白质编码基因的表达水平，在我们开始这个项目的时候，也就是2006年，对非编码rna的知识并不多。
所以我们认为研究一般的非编码分子是值得的。其中许多只在特定的组织中进行分析，比如大脑，它是非编码rna非常丰富，或者胎盘，它也非常丰富。(但没有人在非常广泛的基础上研究过这些分子。所以我们认为，看看非编码RNA分子是否在所有不同的组织中普遍表达会很有趣。
然后，进一步研究，我们说，“让我们将它们与更常用的蛋白质编码内参基因(管家基因)进行比较，看看我们是否在所有这些不同的组织中都有所有这些非编码RNA分子的表达。”通过观察这些数据，我们可以看到一些非编码RNA分子更加稳定。
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此外，由于分子的生物成因，我们认为如果[研究npcrna的研究人员]不依赖蛋白质编码基因可能会更好。
在某种程度上，非常有趣和令人惊讶的是，其中一些分子不仅在我们分析的所有组织中普遍表达在或多或少相同的水平上表现出非常高的稳定性，而且动态范围也非常有趣——这些非编码RNA分子基本上[表现]出了8个数量级的差异……[而]大多数蛋白质编码管家基因[表现]可能只有3到4个数量级。所以非编码分子基本上沿着表达水平扩散得更远。
这是意外吗?
不一定，不。我们实际上不知道，所以我们看着它，发现这很有趣。我们当然知道其中一些分子是强表达的因为Northern blot使用了很多核糖体RNA等作为对照，所以我们从同事的结果和文献中知道其中一些分子是重度表达的。但是其他分子，我们也从文献中知道，在Northern印迹中很难检测到，比如U105 [snoRNA]，它也是表达最低的分子之一，在组织之间也表现出一些差异。
你的论文指出，管家基因实际上在不同的样本中表现出很大的差异。听起来你目前所看到的表明家政rna不会是这样的。
这是其他人从2002年开始经常报道的[参考基因]。很多人报告说如果你在不同的条件下观察许多内参基因并不是那么稳定。如果你比较相同的组织或相同的样本，那么使用单一的参考基因可能是可以的，但如果你想比较不同组织中的表达水平，那么你必须有多个参考基因。这正是Vandesompele[和他的同事]想出来的。在一篇发表于在基因组生物学——事实上，你需要不止一个推荐人。
所以这就是为什么我们说，‘好吧，我们将经历整个过程，采用所有这些不同的方法，寻找这些非编码rna的稳定性。’我们分析了很多这样的分子。
当有这么多的初始内务rna可供选择时，你是如何想出第一组18个初始内务rna的?
我们和Münster的同事讨论了这个问题，他们是这方面的共同作者。我们主要想要的是有一组相当多样化的分子，它们来自不同的类别，甚至可能位于细胞的不同部位。所以我们希望有一个广泛的集合，因为如果你选择一个太窄的集合——涉及同一途径的参考基因，或者其他什么——那么实验条件可能对表达水平有更大的影响。所以我们想把它们广泛地分布开来。
这是一件事。另一件事是，在这18个病例中，我们选择了其中一些病例，因为据报道它们具有组织特异性，所以它们是我们的测试案例。据报道，BC200 [scRNA]和HBI-36 [snoRNA]在大脑中强烈表达，而在其他组织中没有表达，或者至少通过Northern blot，在其他组织中没有真正检测到，所以我们知道它们不会成为良好的家务基因。
然后，当然，其中一些表现出不同的表达水平。核糖体rna显然非常丰富，而其他一些分子则不是。
考虑到非编码RNA是一个相对较新的研究领域，你对你最终得到的这组管家RNA的寿命有什么看法?随着新的rna的发现，这种情况可能会改变吗?
你越努力找，就会发现越多。很明显，在未来几年内，这套标准并不一定适用于所有应用程序。然而，我们认为至少前五名的候选RNA分子都有很好的特征，也都是众所周知的RNA分子，而且它们在细胞内的丰度也不同。它们似乎表达得相当稳定。我不确定周围是否有那么多稳定表达的RNA分子还没有被发现。
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在某种程度上，这也取决于你的实验条件和你想回答的科学问题。但我认为这是一个很好的起点，这正是我们在这里提出的:在这个集合中，肯定有一些分子适合作为一个起点来分析我们想要使用的实验条件。所以，例如，如果你想在不同的压力条件下使用细胞或其他什么，那么你可能会发现差异，但[在你的实验中使用]其中一些[分子]应该会消除这种差异。
下一步该如何推进这项工作?
显然，你可以在某些组织中研究更多细节。例如，如果你研究大脑，观察不同的大脑区域会很有趣，或者观察某些类型的细胞——神经细胞或其他什么细胞——也会很有趣。所以我认为这是你想要深入研究的问题。
我们采用了相当广泛的方法，选取了20种非常非常不同的组织，主要是因为一开始的想法是研究生物信息学预测的分子，所以显然我们不知道它们是否是组织特异性的。所以我们需要一个非常广泛的基础。
考虑到非编码RNA是一个如此热门的研究领域，为什么你认为这是第一个为这类实验提出标准化参考分子的工作?
对于microrna，人们已经对此进行了研究，但这项工作也是最近才发表的。我们没有把重点放在microrna上，因为我们使用SYBR Green作为检测方法，而不是TaqMan探针，显然对于microrna来说，基本上不可能建立探针。因为这来自于测试预测分子的想法，这些分子更长，所以这就是为什么我们坚持在这里描述的集合。
所以对于microrna，人们已经研究过了，但是对于非编码rna还不是很普遍。我认为其中一个原因是实时聚合酶链反应在这个领域还没有被广泛接受。大部分工作都是基于不同的实验方法——Northern blots和观察功能等等，而不是这种高通量的方式。
你的发现对大多数使用实时PCR研究非编码rna的研究人员意味着什么?对他们来说，开始在实验中加入推荐的rna会是一个简单的改变吗?
我认为这很简单。这就是它的美妙之处。这些分子的特征已经很明确了。对于SYBR Green平台，它应该同样简单。这只是时间问题，人们可能会注意到的。其中一些非编码分子以前曾被用作参考，但它们从未真正被系统地描述过。核糖体RNA被使用过，U6 [snRNA]以前也被使用过，但只在一两篇论文中。大多数人还没有真正研究过这个问题。
在一个实验中使用多个内参基因的概念如何?我知道这样做仍然存在一些阻力，至少在蛋白质编码基因表达实验中是这样。
我认为我们的论文在RNA领域发表得正好，因为(这一领域的研究人员)刚刚开始研究(实时PCR)，所以人们可能不会犯在其他领域犯过的错误。
在某种程度上，我可以理解为什么人们使用单一参考，因为管家基因只是被认为在细胞与细胞之间是稳定的，然后才有报道说存在变异，你需要使用更多。
你和你的同事下一步要做什么?
我们实际上还在研究生物信息学预测的分子，所以希望我们能很快找到一些东西。我们也在研究表达式标尺的概念。由于我们发现在表达强度上存在如此巨大的数量级差异，人们实际上可以使用一些非编码RNA分子作为表达指标，与Northern blot数据进行比较。
这将是一种标准化的努力，但我们认为，到目前为止我们所产生的数据实际上将[证明]使用这些实时PCR方法作为一种质量标准或参考其他实验方法的可能性。
这就是为什么我们在工作中纳入了[定量实时PCR实验发布的最低信息]标准的原因之一。