纽约(GenomeWeb) -系统生物学研究所的研究人员开发了一种利用斯沃思式数据独立采集质谱仪改进蛋白质翻译后修饰分析的方法。
详细内容在上个月发表的一篇论文中分子与细胞蛋白质组学ISB研究员、该论文的高级作者罗伯特·莫里茨(Robert Moritz)告诉基因组网(GenomeWeb)，该方法允许无偏倚地检测蛋白质pms，比使用传统的霰弹枪质谱仪具有更高的灵敏度。
ISB目前正致力于实现该方法的自动化、开放访问版本。莫里茨表示，该公司还在与Sciex合作，将其开发成一款独立的软件产品或一种工具，可以集成到该公司与Illumina合作的云计算OneOmics环境中。
近年来，Swath和相关DIA方法的使用显著增加，研究人员被该技术提供数千种蛋白质的可重复定量数据的能力所吸引。然而，Moritz指出，到目前为止，这种方法还没有特别适用于蛋白质PTMs的分析。
他说，这是由于在Swath实验中使用的数据分析方法，其中由初始DDA运行生成的光谱库用于查询Swath数据集，以确定特定肽的存在。如果一个修饰过的肽没有出现在这个谱库中，那么它就不会在Swath数据中被检测到，大量的潜在修饰使得覆盖所有不同的可能性成为一个重大的挑战。
莫里茨说:“问题是，你必须在光谱库中拥有肽的每一种可能的修改成分组合。”“所以你要么必须从天然来源[编译]，要么必须[使用合成肽]。这是一个非常困难的方法。”
莫里茨和同事，包括ISB计算生物学家安迪·凯勒，该研究的第一作者MCP论文中，他们开发了一种名为SwathProphet的工具来解决这个问题天车他们在Swath数据中确定了可能含有修饰的前驱体离子，然后使用调整后的前驱体窗口重新提取这些离子，以考虑修饰所增加的质量。
从本质上讲，该工具通过识别缺失片段离子峰的峰群来寻找可能的修饰肽，其概念是，这些片段离子峰可能缺失，因为它们包含修饰，因此没有出现在预期的m/z窗口中。该软件获取这些候选峰群，然后使用适用于缺失片段离子的修改版本的m/z窗口重新分析它们。
这允许在新的m/z窗口内对修饰肽进行无偏倚的swath式检测。莫里茨说:“一旦我们能够检测到具有特定质量差异的肽，我们就可以从质量差异中解释这种修饰可能是什么。”
在MCP论文中，研究人员在几个不同的样本中测试了这种方法，包括一组1055个重标记合成肽，加入纯溶剂或胰蛋白酶化的人类尿液背景中，以及通过固定金属亲和层析，使用Fe(III)和氧化钛富集磷酸肽的人类转移性乳腺癌细胞系裂解液。
在第一个实验中，他们在三个数量级上鉴定出209种改性合成肽和65种改性人尿肽。在第二个实验中，他们鉴定出210个磷酸化肽。
而最初的散弹枪实验用来生成光谱库的实验与磷富集细胞系鉴定出明显更多的磷酸化肽，1367,SwathProphet天车重要的是，能够识别在原始霰弹枪实验中没有检测到的磷酸化肽，因此在用于Swath分析的传统部分的光谱库中不存在。
作者指出，这表明该软件“可以识别以前未检测到的生物翻译后修饰，如磷酸化事件，而无需预测，仅基于未修饰的肽分析。”
这一点很重要，因为尽管光谱库继续增长，但考虑到大量可能的修饰和遗传多态性，它们很可能始终是不完整的，而这些不存在于光谱库中的修饰将无法用传统的Swath分析方法检测到。
此外，用于生成光谱库的散弹枪方法倾向于更高丰度的修改，因此SwathProphet天车提供了更敏感地检测低丰度PTMs的可能性。事实上，该方法在MS2而不是MS1水平上寻找修改，也可以提高灵敏度。
Moritz说，由于该方法在宽m/z范围内以无偏的方式寻找ptm，它也为研究人员提供了识别不太常见的修饰，包括由于实验室污染引起的非生物修饰的机会。
他说:“人们总是假设你使用的试剂是纯的，但当你在进行生化提取时，你可能在修改肽，而不知道你实际上是在使用货架上已经有一段时间的试剂。”“这可能会影响你的定量，因为如果你纯粹基于检测未经修饰的肽，那么你可能会对你实际拥有的进行不足抽样。”
Moritz表示，他预计这种方法将在ISB成为对所有Swath数据进行额外分析的标准方法。他说，该方法目前在ISB研究人员开发的跨蛋白质组学管道(Trans-Proteomic Pipeline)的质谱信息学套件中可下载，并补充说，ISB也正在与Sciex合作开发该方法的一个版本。
该软件“以一种全球和全面的方式推动我们，不仅是直接的蛋白质分析，而且还涉及翻译后修饰和蛋白质处理的微妙之处，以及修改初级结构可能发生的许多不同的事情，”ISB总裁兼联合创始人、该研究的合著者Leroy Hood说MCP他告诉基因组网。
更一般地说，Hood指出，在计算方面，正在进行的大量投资将进一步充实斯沃思式质谱仪。
他说:“能够看到片段窗口是一回事，但能够在肽是什么以及它们代表的蛋白质是什么这一背景下解释它们是另一回事。”“所有这些都需要极具挑战性的计算工具。”