纽约(基因组网)-德克萨斯大学的研究人员开发了一种基于Edman降解的单分子蛋白质测量方法。
详细的在一篇论文本周发表于自然生物技术vwin德赢ac米兰合作德克萨斯大学分子生物科学教授、该研究的资深作者Edward Marcotte说，该方法可以利用下一代测序技术为核酸实验带来的高灵敏度和数字定量能力，对复杂的蛋白质混合物进行分析。
Marcotte和他的同事们成立了一家名为Erisyon的公司，将这项技术商业化。vwin德赢ac米兰合作
他们的工作是一些实验室开发单分子蛋白质分析技术的小规模但不断增长的努力的一部分。代尔夫特理工大学Kavli纳米科学研究所主任Chirlmin Joo表示，目前全球有十多个研究小组正致力于这一研究。vwin德赢ac米兰合作
Joo没有参与UT的工作，他说可能有一半的团队正在研究基于纳米孔测序的方法，但其余的团队正在探索各种各样的方法。
Marcotte的群体就属于后者。他们的方法，Marcotte将其描述为NGS和质谱的混合元素，使用荧光标记目标肽上的特定氨基酸残基，然后对这些肽进行Edman降解。通过将多肽固定在玻片上，并使用显微镜测量通过Edman降解从这些多肽中去除标记氨基酸残基时荧光的下降，他们能够获得这些分子的部分序列。
然后，他们可以将这些部分序列与参考数据库相匹配，进行肽和蛋白质的鉴定。
Marcotte指出，该工作流程的第一部分类似于NGS的一些工作流程，因为它是一种基于测序的方法，可以监测荧光的变化，并并行分析数百万个分子。
另一方面，工作流的数据库匹配部分类似于自底向上的质谱仪方法，其中研究人员将实验生成的肽数据与参考数据库进行比较，从而进行肽识别。
Marcotte说:“我们可以通过从参考数据库中提取蛋白质序列，生成[硅]荧光序列并比较[实验生成的]荧光序列来解释非常相似的数据(质谱仪数据)。”他补充说，该技术应该能够使用许多相同的方法来评估目前用于质谱仪分析的错误发现率。
然而，在完成肽或蛋白质鉴定之后，该方法再次变得类似于NGS工作流程，他说，在NGS工作流程中，“量化是数字化的。”
“我们正在直接计数分子，”他说。“所以，它看起来就像RNA-seq数据，我们使用基于计数的统计来计算丰度。”
Marcotte说，这种单分子计数方法比基于质量谱的方法具有更高的灵敏度。在自然生物技术论文中，研究人员在zeeptomolar水平识别了简单混合物中的多肽。
研究人员目前能够同时测量大约100万个分子，但Marcotte说，扩大到10亿个分子将相当简单。
“基于下一代测序领域，我们已经知道如何做到这一点，”他说。“这主要是滑梯上的更多房地产。经验非常简单。”
更有挑战性的是目标氨基酸的荧光标记问题。NGS通常使用基于合成的方法来跟踪核苷酸添加到核酸中，而UT方法是基于降解的方法，跟踪从被分析的多肽中去除氨基酸。
Marcotte说，这意味着用于标记的荧光染料必须经受得住Edman降解中使用的相对恶劣的化学条件，而识别在这些条件下继续工作的染料被证明是一个挑战。
他说:“我们筛选了大约25种染料，选出了两种能够在化学反应中存活下来的染料。”“我们目前只有两种染料，但我们可能会识别出其他染料。”
他说，与标记的两种氨基酸(半胱氨酸和赖氨酸自然生物技术研究)，该技术可以准确地识别含有1000种不同蛋白质的混合物中的蛋白质。他说，四种氨基酸的标记将使它能够精确地识别具有人类蛋白质组复杂性的混合物中的蛋白质。
染料与活性手柄相连接，选择性地标记所需氨基酸，到目前为止，Marcotte和他的同事们已经成功地用这些手柄专门标记了20种人体氨基酸中的5种。
“我不认为有任何理由我们不能达到一半的[20种氨基酸]，”他说，并补充说，标记的氨基酸的数量可能取决于一个给定的实验的目标。
他说:“这涉及到信息内容以及你希望读取的内容有多丰富。”他将这与调整DNA测序中的读取长度进行了比较。“在某些情况下，如果你想进行定量分析，短时间的阅读就足够了，有时你可能想要更长时间的阅读，因为你想做一些涉及到了解基因结构的事情。在我们的情况下，我们可以根据应用程序选择标签的数量。”
Marcotte说，该技术的主要误差来源更类似于在NGS中遇到的，而不是质谱仪。
他说:“质谱仪是基于质量而做出错误的，比如如果(一个肽)是等压的，你就会犯归因错误，而我们在这里做的是测序错误。”“我们有插入、删除和替换。如果切断一个氨基酸的化学反应在一轮中失败了，我们在下一轮继续，就会导致序列的明显插入。如果我们破坏了一种染料，它看起来就像是一种取代物。”
“现在，就像早期的DNA测序一样，(这项技术)仍然有很多错误，”他说。vwin德赢ac米兰合作“改进我们的染料，延长我们的读取长度，提高所有过程的效率，添加更多的颜色是明显需要改进的领域。”
Marcotte说，与其他蛋白质组学方法一样，该方法将需要预先富集或消耗样本或分离样本，以处理蛋白质组的高动态范围。他补充说，他和他的同事们还致力于改进该系统能够处理的极低丰度样品的样品制备方法。
总部位于德克萨斯州奥斯汀的Erisyon公司今年早些时候启动了这项技术的商业化，该公司首席执行官Talli Somekh说，该公司不相信这种方法会取代质谱仪和基于亲和的蛋白质组学方法，但它可以开辟新的研究领域vwin德赢ac米兰合作，“因为评估它们的技术相当差，所以这些领域还没有被充分开发。”
他举了一个翻译后修饰分析的例子，他说，Erisyon相信其标记特定pms的能力将允许研究人员“以单分子分辨率评估单个蛋白质上的多个翻译后修饰”。
他还提到了免疫肿瘤学和蛋白质-蛋白质相互作用研究领域，认为该技术可以在这些领域找到早期用户。vwin德赢ac米兰合作
Somekh拒绝讨论到目前为止公司是如何获得资金的，也拒绝提供公司希望何时将初始产品推向市场的时间表，但他表示，他相信“开发道路应该相当快。”
他指出，Marcotte实验室有三个版本的设备正在使用中。
他说:“这并不是说我们只是对一个概念进行验证，然后试图将其发展到可以产品化的程度。”“我们已经准备好将其产品化。”
他补充说，该公司目前正在与几个学术实验室和工业合作伙伴合作，开发该系统的商业版本。
代尔夫特大学的Joo说，UT方法看起来很有前途，并指出其分析蛋白质PTMs的能力特别有趣。不过，他补充说，单分子蛋白质分析还处于相对早期的阶段，很难说哪种或哪种技术最终会得到广泛采用。vwin德赢ac米兰合作
Joo还开发了一种基于荧光的蛋白质分析方法。他的方法使用ClpXP蛋白酶，它能使目标蛋白变性和降解。通过使用FRET监测这一过程，Joo和他的同事能够像Marcotte的团队一样检测到标记氨基酸的去除，尽管Joo的方法专注于全长蛋白质而不是多肽。今年8月，他成立了一家名为Bluemics的公司，将这种方法商业化。
正如Joo所指出的，单分子蛋白质研究的很大一部分都是围绕纳米孔展开的，纳米孔已经成功地用于核酸测序。
牛津大学化学生物学教授、基于纳米孔测序公司牛津纳米孔技术的联合创始人哈根·贝利(Hagan Bayley)已经做到了证明的能力纳米孔传感器来区分不同的磷酸化蛋白质形式。
加州大学圣克鲁斯分校的纳米孔研究员、生物分子工程教授马克·阿克森(Mark Akeson)已经完成了这项工作设计了一个方法驱动折叠蛋白通过α-溶血素纳米孔模型，并利用它来区分蛋白质上不同的序列依赖特征。
去年，格罗宁根大学的研究人员证明的能力Fragaceatoxin C (FraC)纳米孔用于识别简单混合物中的肽和蛋白质生物标记物，并区分仅有一个氨基酸差异的多肽。
基于纳米孔的方法的主要优势之一是，与基于荧光的方法不同，它们不需要对蛋白质底物进行任何修饰，Joo说。
“所以，从这个意义上说，纳米孔是有吸引力的，”他说。“但是，纳米孔也有其局限性，所以人们正在寻找许多不同的可能性。”
另一家进入这一领域的公司是总部位于圣地亚哥的初创企业Encodia，据其网站称，该公司正在“开发新技术，以创建可扩展和并行化的蛋白质分析方法”。
该公司包括几位NGS界的资深人士，包括其首席执行官、Illumina的联合创始人马克•奇;凯文·甘德森(Kevin Gunderson)， Illumina公司前高级主管，推动该公司的研究，也是该公司的创始科学家;以及454测序的发明者之一迈克尔·韦纳。
Chee拒绝透露公司的计划，并指出这仍是一个早期的创业项目，但Encodia今年从美国国家普通医学科学研究所(NIGMS)获得的222,959美元的资助，为该公司解决该领域的方法提供了一些见解。
根据授予在美国，该方法将dna标记的多肽与一种“Edmanase”酶结合，这种酶能够每次轻轻降解一个氨基酸的多肽。去除后，可以使用传统的NGS对DNA标签进行测序，允许读出标记的肽序列。
除了NIGMS拨款外，Encodia今年还获得了来自国家癌症研究所的718,340美元拨款和2016年NCI的211,400美元拨款。