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纽约——一种新的单细胞RNA测序方法可能会带来三重威胁:高灵敏度、RNA全长覆盖范围和高通量。
这种被称为“通过da -tail对单细胞进行大规模转录组分析”(VASA-seq)的方法背后的研究人员声称，与现有的高通量方法(即10x Genomics的Chromium平台)相比，这种方法能够捕获更多的rna，从而使每个细胞以及被分析的异构体和长非编码rna获得更多的基因。它可以用平板和液滴的方法进行细胞分离，成本约为美元。98加$。每个细胞分别有11个。
在本周发表的一项概念验证研究中自然生物技术vwin德赢ac米兰合作美国剑桥大学(University of Cambridge)、荷兰Hubrecht研究所(Hubrecht Institute)等机构的研究人员使用VASA-seq对发育中的小鼠胚胎中的3万多个细胞的转录组进行了测序。他们报告了每个细胞9825个基因的vasa缺失，每个细胞的测序深度为75,000个裁剪reads, vasa板的测序深度为9,425个。
“我们发现了细胞类型标记，许多基于非编码RNA，并进行了研究在活的有机体内通过检测非聚腺苷酸化组蛋白基因进行细胞周期分析，”作者写道。“此外，我们的VASA-seq数据提供了哺乳动物发育过程中替代剪接的全面分析，突出了血液发育和心脏形态发生过程中的大量[基因组]重排。”
＂研究实验室越来越多地依赖于单细胞RNA-seq方法，以提供他们想要研究的生物系统潜在异质性的关键见解，”剑桥生物化学家、该论文的资深作者弗洛里安·霍尔菲尔德(Florian holfelder)在一封电子邮件中说。“如果能在每个细胞中检测到更多的分子和标记，不仅能提高细胞类型注释的精度，还能更全面地识别该细胞类型固有的独特基因表达模式。”
此外，这些数据可以用于宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的单细胞基因表达研究人员Hao Wu说:“这为先前特征不明显的非聚腺苷酸化非编码rna在发育过程和疾病中的基因调节功能提供了新的机制见解。”
holfelder说，基于平板的检测版本已经可以从一家商业服务合作伙伴——荷兰的单细胞发现公司(Single Cell Discoveries)获得。他补充说，他和他的团队已经申请了知识产权，正在考虑不同的商业化途径。他建议，能够在高通量下进行多步反应的商用仪器，如Mission Bio公司的Tapestri单细胞平台，目前主要用于单细胞DNA测序和蛋白质组学，“可能是VASA-drop协议商业适应性的最直接解决方案。”＂
该方法比大多数现有的单细胞转录组学高通量方法更进一步，后者使用条形码与聚腺苷酸化的转录本杂交，只对这些转录本的一小部分进行测序。
VASA-seq可以捕获多聚腺苷酸化的转录物(即信使rna)和非多聚腺苷酸化的转录物(如长非编码、短非编码和某些蛋白质编码rna)。对于全长序列，它也可以检测到可选拼接。这是“在技术上很难在一次试验中实现吴说。
细胞裂解后，rna被碎片化，随后是末端修复和聚(A)尾随步骤。然后这些分子被反向转录并进行第二链合成。生成的DNA分子随后被转录在体外和核糖体RNA的耗尽，然后进行测序适配器连接和另一个反转录步骤，然后进行索引PCR创建最终的测序文库。
在VASA-seq的液滴版本中，这些步骤必须通过单细胞封装后的皮注射进行，因此不太可能与10x铬仪器兼容。
holfelder说，研究人员使用的工作流程“类似于inDrop”，inDrop是哈佛大学研究人员开发的一种单细胞封装方法，由1CellBio公司商业化，“但其他定制系统，如Drop-seq或HyDrop也适用。”
这种液滴仪器的费用约为6万美元;他说，基于平板的版本可以通过液体处理器实现自动化，成本可能高达10万美元。
测序成本约为美元。holfelder说，“但这可能会根据用户的需求而改变。”例如，用户他建议说，科学家可能想要进行浅测序，并在更高的覆盖率下研究特定的文库。他补充说，“增加的RNA捕获为这种方式的实验设计提供了更高的灵活性。”＂
他估计，根据细胞加载浓度的不同，双重率小于5%。
对于标准的基因表达分析，VASA-seq数据与现有的分析工具兼容，如10x的Cell Ranger软件，Kallisto, zUMIs, Alevin和STARsolo。holfelder说:“然而，小的非编码rna的分析可能会因为高的多重映射率而变得复杂，需要VASA-seq应用程序的进一步开发。”
除了单细胞转录组学和RNA亚型测序外，该方法还可用于研究基因表达动力学holfelder说，这在一定程度上可以预测细胞状态的变化。其中一种方法，RNA速度，是通过比较映射到内含子的读取结果(因此来源于未拼接的RNA)与其他映射到外显子的读取结果。但现有的方法只能捕获最多的5'或3' mRNA片段，他说，“因此捕获的内含子读量较低，这可能会影响RNA速度(测量)的质量。”
吴教授，他开发了一种测定单细胞RNA-seq实验中转录本年龄的方法称为单细胞代谢标记新RNA标记测序(scNT-seq）同意。”更高的拼接和未拼接RNA片段捕获效率可以为RNA动力学分析提供更准确的输入，包括RNA速度。”
“我们证明VASA-seq比目前的方法表现得更好。”Hollfelder说。“不仅某些基因是唯一检测到的，因此它们的动态是唯一捕获的，而且大多数基因的内含子和外显子reads的比例更平衡，这在RNA速度的情况下，增强了动力学建模。＂
除了“单细胞发现”，holfelder说，基于平板和液滴的协议正在其他实验室中实施，但他没有提供更多细节。