纽约(GenomeWeb)——荷兰Hubrecht研究所的研究人员已经开发出一种新方法，可以对同一个单细胞的基因组和转录组进行测序。
该方法被称为DR-Seq，用于gDNA-mRNA测序和发表在自然生物技术vwin德赢ac米兰合作今天，采用准线性扩增，不分离基因组DNA和mRNA。它可以帮助科学家更好地理解基因组变异对各种细胞类型基因表达的影响。
在过去的几年里，不同的小组已经开发出了对单细胞的基因组或转录组进行测序的方法，这已被证明对研究异质细胞群(如肿瘤中的细胞群)非常重要。
然而，到目前为止，这些单细胞方法还不能让研究人员直接研究基因组的变化——无论是单核苷酸变异还是拷贝数变异——是如何与基因表达的变化相关的。
为了克服这一限制，荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的研究人员开发了DR-Seq，使他们能够并行地对同一细胞的基因组和转录组进行测序。
“我们想开发一种单罐策略，”基因组DNA和mRNA最初不分离，以防止材料损失和污染，该论文的第一作者、胡布莱希特研究所亚历山大·范·乌德纳尔登小组的博士后西达斯·戴伊(Siddarth Dey)解释说。
该方法首先溶解一个人工提取的细胞，并使用包含细胞特异性条形码、5' Illumina适配器和T7启动子的引物，将其信使RNA逆转录为单链cDNA。
然后，基因组DNA和单链cDNA进行准线性全基因组扩增7个周期，使用一个引物，该引物具有确定的27个碱基序列，在5'端跟随8个随机核苷酸。根据Dey的说法，这个放大步骤建立在MALBAC方法的基础上出版于两年前来自哈佛大学谢sunney Xie的团队。
在此之后，科学家们将样本分成两部分，其中一部分在21次PCR循环中扩增基因组DNA，另一部分将单链cDNA转化为双链cDNA，然后将其放大成RNA在体外转录。
然后将扩增的基因组DNA转化为细胞特异性索引Illumina测序文库，而RNA则进行NGS RNA文库制备。
单细胞转录组测序方法的一个问题是扩增偏倚，它扭曲了细胞中存在的mRNA分子的原始比例。其他方法通过在逆转录引物中使用随机条形码来克服这个问题，它唯一地标记来自相同原始mRNA分子的所有分子。
然而，这种方法在DR-Seq中不起作用，Dey说，所以他们不得不提出另一种方法，在准线性扩增步骤中使用引物的退火位置来识别独特的mRNA分子。
作者写道，这个引物位置，他们称之为“基于长度的标识符”，“有可能减少扩增偏差和技术噪声，以实现对cDNA分子原始数量的量化”。
为了评估DR-Seq的性能，他们对来自小鼠胚胎干细胞系的13个单细胞的mRNA和其中3个细胞的基因组DNA进行了测序，并将结果与现有的单细胞基因组和转录组测序方法进行了比较。
对于mRNA测序，他们将结果与在33个单细胞上进行的线性扩增和测序(CEL-Seq)的细胞表达结果进行了比较，发现这两种方法检测到的基因数量相似，并且有大约9700个共同基因。Dey说，在动态范围和灵敏度等几个指标上，这两种方法表现相似。
他们还分析了基因组DNA测序，将他们的结果与MALBAC方法的结果进行了比较，他们在三个单细胞上使用了MALBAC方法。他们发现，这两种方法都比批量测序显示出更大的覆盖偏差，但彼此表现相似。
接下来，他们将DR-Seq应用于一个乳腺癌细胞系，对21个细胞的mRNA和其中7个细胞的基因组DNA进行测序。他们发现，基因的平均表达与该基因组区域的拷贝数密切相关。
此外，他们发现转录数的细胞间变异性通常随着拷贝数的减少而增加，而随着拷贝数的增加而减少。Dey解释说，一个可能的解释是，基因表达被认为不是连续发生的，而是突然发生的。他说，如果一个基因有几个副本，这种“爆发行为”就会平均下来，导致基因表达的变化更少。他补充说，他们还没有证明这一假设。
Dey和他的同事目前正在使用液体分配机器人进行DR-Seq自动化，以使其更高的吞吐量并进一步减少技术变异性。他们还在与一家未公开的公司合作，以提高自动化程度。“现在，我们一天可以观察800个细胞，”他说，而“一两年前，当我手动做这件事的时候，我可能只能观察20个细胞。”
能够分析数百个细胞将有助于实际应用，例如，识别肿瘤内的亚群和研究耐药性。Dey说，除了肿瘤分析，该方法还可以应用于神经元，已知神经元携带体细胞拷贝数变异，尽管尚不清楚这些变异如何影响基因表达。
他说，另一个感兴趣的领域是多倍体细胞，如肝细胞，在这些细胞中，染色体的扩增对基因表达有什么影响尚不清楚。
Dey还在研究其他研究单细胞的综合方法，比如分析DNA甲基化和转录的方法，或者同一细胞中核小体的位置和转录的方法。他说:“这将使你有可能将表观遗传变化与基因表达联系起来。”