纽约(GenomeWeb) -最近发表的两种测序方法证明了系统揭示基因组中CRISPR/Cas9活性的意外后果的能力。
专家表示，随着基因编辑技术越来越接近临床治疗用途，这些方法可以为研究人员提供一个准确和公正的工具，来衡量基因编辑技术的特异性。vwin德赢ac米兰合作
Cas9核酸酶创造双链断裂的能力是CRISPR的关键，但科学家们一直在报告脱靶效应，并且必须设计他们的实验来解释它。
“我们仍在了解Cas9核酸酶技术的特异性的过程中，”布罗德研究所的CRISPR/Cas9研究员冉飞(Fei Ann Ran)说，他没有参与这两份出版物vwin德赢ac米兰合作GenomeWeb．了解脱靶效应对于能够自信地使用该技术修改基因组靶标非常重要。vwin德赢ac米兰合作“在这个领域没有一个黄金标准的方法，”她说。
与基于慢病毒载体的方法一起，这两种测序方法代表了一套新的工具来确定Cas9核酸酶活性的影响。
最近两篇描述这种方法的论文都发表在12月自然生物技术vwin德赢ac米兰合作．在其中一项研究中，由蔡圣达和郑宗礼领导的马萨诸塞州总医院的研究人员，描述了一种方法称为全基因组，通过测序(GUIDE-seq)实现双链断裂(dsb)的无偏鉴别。
与此同时，由Richard Frock和Jizazhi Hu领导的波士顿儿童医院的科学家们描述了一种改进的方法高通量全基因组易位测序(HTGTS)，检测工程核酸酶产生的dsb，包括Cas9、TALENS和锌指核酸酶，以及其他过程。
这两种方法都可以检测基因组中的dsb，通常表现为indel突变。当这些发生在蛋白质编码区域时，它们会导致蛋白质在翻译过程中的帧移位和早期截断。它们可能还会击中调节区域，从而改变基因的表达方式。
现有的技术允许研究人员以合理的特异性程度使用Cas9，包括“双重攻击”由布罗德研究所的张和丘奇实验室开发的方法;蔡和郑论文的资深作者Keith Joung开发的截断导向rna;和FOKI-dCas9融合，由哈佛大学的David Liu和MGH的Keith Joung实验室开发，后者是GUIDE-seq论文的高级作者。
有几种方法可以衡量脱靶效应。例如，可以使用ChIP-seq来观察Cas9的DNA结合，或者假设脱靶位置与引导RNA给出的靶序列同源，并使用深度测序来寻找脱靶活性。但这些方法受到一个基本限制的影响:“你只能在你寻找的地方找到东西，”蔡康永说。
Ran解释说，这些新论文令人兴奋，因为它们是首批技术进步之一，允许研究人员以公正的方式研究全基因组Cas9特异性。
GUIDE-seq方法的工作原理是通过非同源末端连接过程，用钝的34碱基对双链寡核苷酸标记基因组中的dsb。该外来诱饵寡聚物具有磷酸修饰，以保护其不受外切酶活性的影响，并提高与dsb的整合效率。蔡崇信说，他能够将这些标签纳入大约三分之一的dsb。
在DSB标记之后，研究人员使用引物选择性地扩增了基因组的这些部分，这些引物补充了寡核苷酸中的每个链。这可以在标记的两侧读取相邻的基因组序列，这是必要的，因为标记可以在两个方向上与DSB结合。
扩增步骤产生一个测序文库，用于Illumina MiSeq仪器的高通量测序。
为了寻找重叠的读取(因为标签可以在两个方向上与DSB结合)，研究人员将它们作为进入DSB的窗口，并将它们映射到核苷酸水平。
guide -seq表明，CRISPR/Cas9引导rna可以在0到150多个位点诱导脱靶活性。GUIDE-seq可以检测到频率仅为0.1%的脱靶活动。在许多情况下，现有的确定脱靶活性的方法无法预测dsb的位置。作者写道，通过更深入的测序，GUIDE-seq方法仍可能得到改进。
此外，Tsai和他的同事使用guide -seq显示，截断约17或18个核苷酸(而不是100个)的引导rna可以导致脱靶活性降低三倍。该技术还揭示了与CRISPR/Cas9完全无关的DSB热点。
同样，Frock等人使用高通量测序结合线性扩增介导的PCR指出易位，显示出脱靶活性。
从CRISPR/Cas9脱靶活动来看，“我们可以证明发生了数百种易位”，资深作者弗雷德里克·阿尔特(Frederick Alt)说。“我们知道它们会去哪里，以及潜在的损害是什么。”
这项概念验证研究观察了四种靶向RAG1基因的引导rna的脱靶活性，RAG1基因是人类基因校正治疗的提议靶点。
HTGTS从两种引导rna中检测到33个显著的热点，但从其他两种中没有检测到。此外，研究人员使用HTGTS来证明双切口法Ran首先描述的，降低了CRISPR/Cas9脱靶活性。
在一个角度块在同一期的自然生物技术vwin德赢ac米兰合作德国海德堡国家肿瘤疾病中心和德国癌症研究中心的Richard Gabriel、Christof von Kalle和Manfred Schmidt指出，位于同一染色体上的序列与诱饵序列将优先融合到诱饵序列上，因此HTGTS“在使用特定诱饵序列时可能高估了靶上和脱靶的比例，或者高估了脱靶双链断裂的频率它们与诱饵序列位于同一染色体上．"
然而，HTGTS明确表明，CRISPR/Cas9的脱靶效应可不仅仅是微不足道的。
Ran说:“人们长期以来一直怀疑的一件事是，这些核酸酶裂解可以导致易位和更大的结构重排，比indel突变更广泛。”
这凸显了在CRISPR/Cas9被用于临床治疗之前，了解脱靶活性背后的规则的重要性。
GUIDE-seq论文的作者之一Tsai说:“你可以想象，如果你在治疗数十亿个大细胞群，你会想要了解低水平的脱靶效应。GenomeWeb．“如果你击中了肿瘤抑制基因，可能会造成有害影响。”
Ran说，了解CRISPR/Cas9的特异性也可以帮助预测给定的靶上或脱靶的切割效率。“我们可能会对支配Cas9特异性的规则有更多的了解。在未来，希望我们可以利用这些信息来帮助我们更准确地理解支配Cas9特异性的规则。”她说。
Ran和Tsai都说，理想的情况是一个可以预测任何给定目标脱靶的工具。
Ran说:“这对潜在的临床应用非常重要，其中效率和特异性都非常重要。”