这个故事已经更新，包括来自Encarnita Mariotti-Ferrandiz的额外评论。
纽约——在一项比较了九种不同T细胞受体(TCR)测序方法的新标杆研究中，Adaptive Biotechnologies和Takara Bio提供的免疫细胞测序产品在重复性、可靠性和敏感性方面排名很高。但该研究的作者说，在用这种方法发现的T细胞克隆型方面，面对面的比较揭示了“巨大的系统性偏差”。
在巴黎索邦大学(Sorbonne University)的免疫学研究员Encarnita Mariotti-Ferrandiz的带领下，一个国际研究小组将相同的样本送去，用9种不同的TCR测序方法进行分析，这些方法由开发这些方法的公司或团体执行。除了Adaptive和Takara方法外，该团队还比较了iMonitor、Thermo Fisher Scientific的Invitrogen和iRepertoire以及其他一些领先的实验室协议的商用套件或服务。研究结果于本周早些时候在自然生物技术vwin德赢ac米兰合作．
根据序列读取比对、检测罕见TCRs的能力和tcrb可变基因(TRBV)的使用情况对每种方法进行分析，并与流式细胞术定量的蛋白表达进行比较。研究人员还创建了一个在网上所有方法所发现的克隆型的“元胞壁”;没有一种方法在tcr - α和- β链的母体中发现超过一半的克隆型。
Mariotti-Ferrandiz说，大多数用于tcr - β链测序的方法都表现良好，没有太多的东西可以将它们分离开来。tcr - β链具有更多的序列多样性，因此应用更广泛。然而，测序阿尔法链“有点复杂，而且肯定有一些方法比其他方法更好，”她补充说。
此外，有些方法似乎更适合于具体的问题。Mariotti-Ferrandiz说:“这取决于你想要的是什么，你是想要对曲目有一个真正全面的概述，尽可能地寻求多样性，还是只对主要的扩展感兴趣。”“这不是小事，你不能想用什么就用什么。”
Takara Bio USA NGS营销副总监Suvarna Gandlur解释说，这篇论文有助于澄清一些方法上的差异，比如他们是在研究DNA还是信使RNA。她说，使用DNA作为输入的多重PCR和使用RNA的DNA补充端快速扩增(RACE)方法都有好处。“虽然基于dna的方法可以用于更多定量研究，但基于rna的方法更敏感。”使用唯一分子标识符(UMIs)是一些方法之间的另一个区别。Gandlur说:“ui是有好处的，但并不总是需要它们。”Takara的SMARTer Human TCR a/b分析试剂盒使用(RACE) PCR分析mRNA;她说，在研究中评估的工具包没有使用ui，但它们现在是新工具包的一个选择。
“很高兴看到Adaptive在这次评估中表现这么好，”该公司的联合创始人兼CSO哈兰·罗宾斯(Harlan Robins)在一封电子邮件中说。Adaptive获得了i剧目方法的独家权利，用于最小残留疾病检测2015年收购Sequenta．Adaptive公司的immunoSeq试验仅用于分析tcr - β链，但也可用于分析tcr - α链。
Mariotti-Ferrandiz表示，TCR测序基准项目始于2016年，当时同事们讨论了比较几种不同的方法。适应性免疫谱分析已经成为几个研究领域的关键，特别是肿瘤学，并在诊断中有应用，包括伴随诊断和最小残留疾病检测．
在她的博士后工作、合作和一些商业服务的使用中，Mariotti-Ferrandiz注意到，用相同的方法运行两次相同的样本并不总是产生相同的结果。
她开始与同事们分享她的数据，她说，与她交谈的每个人“都热情地试图将自己的协议与其他协议进行比较”。到2017年，她收集了一个T细胞样本，将其别名，并将其寄出进行分析。研究人员随后收集了第二份样本进行另一轮分析。
她说:“大多数合作者从一开始就真正参与了得到结果和设计适当的分析策略。”“最重要的一点是，我们一直在使用相同的样本。每个实验室都遵循他们最初的方法。我们对如何修改协议没有影响。”她说，所有数据都由同一个人分析，以进一步减少调查人员的偏见。
总的来说，马里奥蒂-弗兰迪兹说，她对任何一种方法都没有留下不好的印象。尽管如此，该研究还是根据灵敏度、再现性和可靠性对每种方法进行了排名。在这方面，Takara Bio和Adaptive公司的方法很突出，德国德累斯顿技术大学开发的tcr - α链测序方法也很突出。
Takara Bio的SMARTer试剂盒在TCR-beta链的重现性和可靠性方面获得了最高级别，在灵敏度方面获得了第二高级别。对于tcr - α链测序，该方法的可靠性最高，重复性和灵敏度第二高。Adaptive公司的immunoSeq测定法仅用于tcr - β链测序，在所有三个类别中得分第二高。
在Mariotti-Ferrandiz自己在自身免疫和炎症疾病方面的工作中，她使用过Takara的试剂盒，并参与了公司对产品提供反馈的早期访问项目。她说:“对人类来说，从血液中提取免疫反应的图像非常重要。”“因为大多数免疫细胞都是器官特异性的，你能从血液中获得的东西应该是非常罕见的。就我而言，我要寻找的是一组罕见的克隆型。”这导致她使用基于RACE pcr的试剂盒。
对她和其他人来说，成本也是一个因素。论文建议Adaptive的试剂盒起价约为350美元/个样本，而Takara的试剂盒起价约为150美元/个样本，其他一些TCR-beta链测序试剂盒或服务的起价约为230美元/个样本。
Adaptive公司的罗宾斯说:“总会有一种技术比另一种技术更适合回答一个问题的情况，但在这种情况下需要记住的一个重要因素是，这项研究的样本多样性有限。”他指出，研究人员只使用了一种类型的样本，CD4+ T细胞。“这里要问的一个重要问题是，这些方法在更临床相关的样本类型(如全血、外周血单个核细胞和组织)中如何表现。例如，大多数肿瘤活组织切片都保存在福尔马林固定的石蜡包埋格式中，而基于rna的免疫测序方法在这类样本中表现不佳。”
他说:“要真正了解哪种方法最适合某个特定的问题，该方法需要针对各种类型的样本进行测试。”他指出，Adaptive已经在“各种各样的样本”中测试了它的检测方法，在其公开的数据库中有超过11000个人类样本。
罗宾斯还指出，在重复性分析中，作者删除了单例。他说:“这种方法从计算中删除了样本中实际存在的克隆，删除数据可能会使分析偏向于难以捕获更罕见克隆的方法。”
删除单例”是一种减少噪声的经典方法，”Mariotti-Ferrandiz说，并指出Adaptive使用未公开的内部过滤器去除其检测中的序列。
Gandlur指出，鉴于COVID-19大流行，人们对免疫系统在传染病中的作用感兴趣。这里，材料输入是一个重要的因素，本文认为对于基于rna的方法，起始材料的数量影响TCR克隆型的多样性。“低RNA输入会影响检测到的稀有TCR序列的数量，但不会影响更丰富的TCR的分布，”作者写道。
免疫细胞分析是一个快速发展的领域，Mariotti-Ferrandiz认识到，该研究并没有捕捉到所有方法的数据，即使是研究构思时存在的那些方法。例如，Adaptive还提供tcr - α链测序，该研究不包括在内，但自2010年以来已作为服务提供。
她计划继续比较各种方法，尽管她不确定这些数据将如何传播。她特别感兴趣的是用ui评估Takara套件。她说:“ui被认为是可以提高数据准确性的东西。”“而且，大多数测序仪都需要这种多样性才能运行，”她补充说，尤其是Illumina的NextSeq平台。