奥兰多-俄亥俄州立大学的研究人员开发了一种快速单分子纳米孔测序方法，可以在几小时内分析急性髓系白血病患者的血液样本，以获得临床可操作的和预后标志物。
由俄勒冈州立大学的Esko Kautto和James Blachly领导的团队在牛津纳米孔技术公司的MinIon测序仪上设计了这项测试，旨在当天分析AML患者的DNA，以便检测到的基因组变异可以用于指导治疗或告知他们的预后。
在本周举行的美国血液学学会年会上，Kautto展示了一项原理证明研究的结果。在这项研究中，他和他的同事们比较了该检测方法测量aml相关改变的能力，以及使用Illumina公司的MiSeq测序仪和毛细管电泳进行短读测序的能力。尽管在临床应用之前，该检测方法还需要在更大的人群中进行进一步的验证和评估，但研究人员希望，在未来，他们的检测方法可能是目前金标准方法的更快、更经济的替代方案。
AML的5年生存率为24%。多年来，化疗是治疗这种基因异质性疾病的唯一方法，但最近，一些分子靶向药物已被批准用于患有某些基因突变的患者。
然而，AML患者通常表现为侵袭性疾病，因此必须迅速接受治疗，通常是在确诊当天。目前的下一代测序测试可能很耗时，这可能会阻碍精准医疗方法的交付。Kautto说:“靶向治疗需要靶向诊断。”他指出，主要学术癌症中心的NGS方法可能需要一个多星期的时间，而无法获得内部检测的私人肿瘤办公室可能需要转介患者。“你可以想象，延迟治疗或开始广泛作用的治疗可能对AML等侵袭性疾病患者有害。”
Kautto认为，如果他的团队能够成功地将纳米孔检测技术用于临床应用，那么它将特别适用于资源有限环境下AML的分子诊断，用于临床试验筛查，作为指导特定药物治疗的辅助诊断，以及用于监测微小残留疾病以评估患者是否可以停用一种药物或进行不同的治疗。
为了开发一种比现有方法更快的测试方法，研究人员决定采用一种纳米孔测序方法，这种方法依赖于一个基于扩增子的库和一个计算管道，该管道在患者数据从仪器流出时立即开始分析。他说:“这样，在几个小时内，我们就可以分析大量的测序数据，并得出样本中任何检测到的突变的最终报告。”“相比之下，当我们已经获得结果时，传统的基于ngs的检测方法仍处于文库准备阶段。”
虽然纳米孔测序据说比传统的NGS更快，而且在仪器成本方面更实惠，但它也被认为有更高的原始读取错误率。
Kautto估计，纳米孔测序的开箱即用错误率约为10%，这在试图检测低频变异时是很高的。他说:“我们花了很多时间分析错误，优化策略以减轻错误，因为我们觉得这是最大的挑战之一。”
Kautto和他的同事们建立了一个质量分数的界限，并过滤掉了质量较低的数据，以降低错误率。他解释说:“这是有可能的，因为将仪器发出的原始信号转换为核苷酸序列的算法有一个内置的定性度量，可以衡量它对基本呼叫的信心程度。”因此，研究人员可以看到得分较低的阅读，并将其排除在分析之外。
此外，研究人员观察的大多数突变都是错义突变，他说这种突变的错误率往往比indel低。
Kautto和同事们比较了纳米孔检测与MiSeq和毛细管电泳检测8个基因(DNMT3A、FLT3、IDH1、DH2、JAK2、NPM1、NRAS、KRAS)在72个野生型和突变样本中aml相关改变的能力。他讨论了三种类型改变的测试性能:JAK2热点突变、NPM1移码插入和FLT3内部串联重复。
在检测JAK2热点突变方面，纳米孔法和Illumina法在8个突变样本中显示出高度相关性，等位基因分数范围广泛，从4%到94%。
研究人员还评估了纳米孔实验测量NPM1移码插入的能力，该移码插入在30%的患者中发生突变，并与缓解后复发风险增加有关。Kautto说，虽然纳米孔测序对indels有很高的错误率，但这是在末端外显子上的一个独特的4核苷酸移码插入。他说:“这种突变特征非常明显，我们可以在背景噪音中捕捉到它，而且它真的不是随机出现在我们的数据中。”
虽然在这种情况下检测到的变异等位基因比例低于预期，但“这可以通过线性模型捕获并进行调整，”Kautto说。
FLT3内部串联复制突变在AML中预后差，可被多种药物靶向。该突变导致外显子13到15的多个部分重复，但这种插入很长，用传统的NGS检测可能具有挑战性。因此，金标准方法是毛细管电泳。
对48个样本进行了该突变的评估，毛细管电泳显示24个呈阳性。纳米孔检测可以检测到所有的病毒，但是传统的NGS检测到24种病毒中只有6种是阳性的。Kautto指出，纳米孔试验检测到与毛细管电泳相似的变异等位基因比例，两者都确定了内部串联重复的几乎相同的长度。
研究人员在一份摘要中报告说，重要的是，纳米孔检测的结果在4到6小时内就能得到，而传统的NGS需要几天。
这种方法也可能有成本优势。在这项研究中，Kautto的团队使用了MinIon流式细胞，对样本进行条形码编码，因此可以在一次运行中对多个样本进行汇总和分析。然而，研究人员估计，用于分析单个样品的Flongle流式细胞的成本低于每个样品250美元。
“出于研究目的，我们使用了条形码方法，”考托说。“理想情况下，开发出更小的芯片，成本更低，我们可以在单个患者身上运行。在临床测试环境中，如果我们进入这些领域，运行这些单一的、较小的芯片会更安全，以避免样本污染。”
在未来，他和他的同事们计划使用来自俄勒冈州立大学白血病组织库的更多样本，以及与其他大学合作的外部队列来验证该测试。他们还希望对在网上计算步骤和文库准备，优化每个目标的覆盖率，并细化其他基因的分析，包括TP53的编码区域。
“我们确实希望最终能够让我们的实验CLIA和/或CAP得到验证，”Kautto在电子邮件中说，尽管他没有提供时间表。