纽约——堪萨斯城儿童慈善组织的研究人员是第一批尝试太平洋生物科学的新能力的人之一:在一次测序中测量基因和表观遗传变异的能力。
现在有了新的软件更新，在PacBio的Sequel IIe仪器上运行的全基因组测序将默认获得基因组中5-甲基胞嘧啶(5mC)模式的数据。
PacBio产品营销副总裁David Miller说:“任何运行HiFi管道的人都将得到四个标准碱基加上CpG图案的甲基化要求。”此前，使用PacBio平台评估罕见病病例的测序和甲基化变异需要多次测试。
作为扩大合作的一部分，儿童慈善组织的研究人员将分析这100个基因组的数据组合，以寻找基因组甲基化的极端情况。
“我们已经成功地在堪萨斯城儿童慈善基金会使用五碱基HiFi测序来识别重复扩展病例中的异常甲基化，我们计划将其应用到我们测序的所有未来基因组，”Emily Farrow，儿童慈善基金会实验室操作主任和密苏里大学堪萨斯城医学院儿科副教授在一份声明中说。
儿童仁慈基因组医学中心主任Tomi Pastinen补充说，他的团队也将把这些数据与PacBio的Iso-Seq RNA测序相结合。他说:“我们现在正在对数百个未解决的案例进行综合分析，我们希望找出新的、以前不为人知的、可能与罕见疾病有关的基因组变异。”
PacBio的化学反应长期以来一直保持着调用表观遗传修饰碱基的能力,通过分析这些基地和其他附近基地合并时的小问题。聚合酶活性的这些停顿表现为荧光脉冲之间的时间间隔，称为脉冲间持续时间(IPD)。PacBio的算法使用IPD中的这些差异来进行表观遗传修改调用。
除了5mC之外，PacBio平台还可以检测到其他类型的修改，但只有这些修改会在每次运行更新的Sequel IIes时被包含在BAM文件中，而且是免费的。“自由,我们的意思是在湿实验室方面不改变方案，不改变样本输入，不改变信息学;一切都是从乐器里直接发出来的。”米勒说。他指出，这一改变确实使数据文件的大小增加了5%。
PacBio首席执行官克里斯蒂安·亨利预览今年2月，他在与投资者的电话会议上使用了这一功能。现在，该公司将其作为SMRT Link v11.0软件的一部分发布，同时发布的还有其他改进，包括新的SMRT Bell工具包，该工具包将样品准备时间减半，并将人类基因组测序的DNA输入要求降低到每个基因组3微克。
PacBio的工艺可以实现甲基化测序，而不需要在样品制备中使用亚硫酸氢盐化学转化，这可能会很苛刻，并可能错过某些SNPs。与标准亚硫酸氢盐测序一样，PacBio的方法不能区分5mC和5-甲基组织胞嘧啶。它并不是唯一可以检测表观遗传修饰的长读测序平台:牛津纳米孔技术可以根据原始信号模式对DNA和RNA进行多种修改。
儿童仁慈基金会能够在早期访问伙伴关系中尝试这种新算法。现在，这些组织正在扩大他们在使用长读序列诊断罕见儿童疾病方面的合作。
Pastinen的团队正在使用该算法生成先前用PacBio平台测序的几个罕见疾病队列样本的甲基化要求。
Pastinen解释说:“一些特定类型的突变，比如重复扩增，会导致患病等位基因的甲基化特征。”重复扩展不一定能直接检测到，因此拥有甲基化数据可以增加调用这些变体的信心。
例如，儿童慈善组织的研究小组已经将高甲基化与被诊断为肌肉萎缩症的患者的DMPK基因重复扩增联系起来，帮助他们做出诊断变异呼叫。“这是一个已知的例子，我们知道长阅读在整个重复阅读中有挑战，”帕斯蒂宁说。在相关甲基化的帮助下，他们能够做出决定。
他补充说，他们还将研究“极端甲基化异常值，以及它们在罕见疾病遗传学中的作用”。“昨天，我发现了一个新的重复扩张，可以抑制一种潜在的新疾病的等位基因。这是这里的下一个前沿，对于所有这些未解决的基因组，我们可以使用直接甲基化(检测)并行注释它们的一些功能。”
除了帮助诊断，甲基化数据"对新基因组生物学有非常令人兴奋的前景，”他说，特别是围绕着亲本起源效应，也被称为亲本印迹。使用短读测序平台(即Illumina)的亚硫酸氢盐测序不能很好地显示甲基化DNA链的起源母体。
现在，帕斯蒂宁的团队将标记基因组中的DNA是来自某人的母亲还是父亲。“初步结果令人震惊，”他说。“在生殖细胞发育过程中，基因组中的大部分甲基化被消除，但真核生物基因组中仍有一些位点被甲基化。”这些区域要么接受父系甲基化模式，要么接受母系甲基化模式。他说:“这些基因座被认为在发育过程中至关重要，并与疾病有关。”
此外，人类基因组中的大部分甲基化变异都是由序列编码的，Pastinen说。“很多时候，人们都是单独研究这两种不同的特征，”他说，但现在，它们可以从同一个样本中同时分析。
甲基化数据也有助于植物和动物基因组研究，这是PacBio测序的一个流行应用。
约翰霍普金斯大学的计算生物学家Michael Schatz在一份声明中说:“我们发现，使用HiFi测序在番茄和玉米基因组中检测到的CpG甲基化模式与标准亚硫酸钠测序高度一致，但为解决转座因子和其他短读无法达到的序列带来了力量。”
Schatz补充说:“当结合HiFi测序用于基因组组装和变异分析的惊人能力时，这为从单一数据类型对植物和脊椎动物基因组进行超高质量基因组和表观基因组分析创造了无与伦比的机会。”
米勒说，除了开展新的研究，研究人员可能还想重新处理旧的HiFi测序结果。“信号一直在那里。这是将其提取并放入BAM文件中。”