巴尔的摩——斯坦福大学的一个研究小组最近展示了纳米孔测序技术在创记录的时间内为危重患者提供诊断的能力，纳米孔测序技术已经进入了快速遗传疾病诊断的领域。但是，尽管这种方法似乎打破了Illumina在临床领域的垄断快速的全基因组测序但是，它的准确性、成本和可扩展性仍然需要在广泛的现实应用中得到验证。
在一个纸发表在《新英格兰医学杂志上周，斯坦福大学团队及其合作者描述了他们的超快速纳米孔全基因组测序方法，该方法包括精简测序、基于云的生物信息学和定制变体优先排序。
在斯坦福大学医学、遗传学和生物医学数据科学教授Euan Ashley的带领下，研究人员在2020年12月至2021年5月期间，使用牛津纳米孔技术公司的最高通量测序仪PromethIon 48对斯坦福大学两家医院的12名危重患者的基因组进行了测序。
在12名研究参与者中，5人接受了基于测序的基因诊断，诊断率约为42%。从样本收集到确诊的最短时间为7小时18分钟，几乎将之前使用Illumina测序创造的世界纪录减半。
“我们仔细研究了管道的每个部分，然后说，‘我们怎样才能让它更快?“阿什利说。
具体来说，他的团队使用Qiagen公司的改良Puregene基因组DNA提取协议和Oxford Nanopore公司定制的文库制备，优化了DNA提取和文库制备的产量、质量和速度。
值得注意的是，他们不是在一个流式细胞上对患者的DNA库进行测序，而是将样本平均分布在48个流式细胞上，在短短1小时50分钟内生成多达200gb的数据，据作者说。他们还通过在每个病人之后清洗和重复使用流式细胞来降低每个样本的测序成本。
为了减少计算时间开销，该团队使用谷歌云平台部署了云计算，以接近实时的方式上传、基本调用和对齐测序数据。测序后，变异被称为使用GRCh37人类参考基因组，产生近450万个单核苷酸变异和每个患者的小插入或删除的中位数。使用超快速评分系统进行定制的变体过滤和优先级排序，将人工评审的候选变体数量减少到29个单核苷酸和22个结构变体的中位数。
牛津纳米孔公司的一位发言人表示:“斯坦福团队表示，他们希望尽可能多地将管道开源，我们正在与他们合作，以实现这一目标。”他补充说，该公司正在重新启用其基于云的Epi2Me分析平台，为快速周转应用提供基本调用。
“恭喜这个团队，”圣地亚哥雷迪儿童基因组医学研究所的总裁兼首席执行官斯蒂芬·金斯莫尔说，他是快速全基因组测序的先驱rWGS,疾病诊断。“什么一个里程碑。”
雷迪的儿童已经对来自北美近80家医院的3000多名危重儿童的基因组进行了测序，并保持了去年在Illumina NovaSeq上使用SP流式细胞以13.5小时的诊断时间创下的记录。
Kingsmore说新的记录对他来说“一点也不”令人惊讶，他指出，将一长段DNA通过一个小孔并通过电子传输序列信号本质上比Illumina测序要快，后者使用的是合成测序方法，而成像和DNA合成限制了速度。
为了提高速度，Illumina测序“已经像柠檬一样被压榨”，Kingsmore说。“但牛津纳米孔公司完全不同。”
然而，Kingsmore认为，即使是基于illumina的rWGS，可能需要长达18个小时，对危重患者来说仍然是“完美的”，因为它在第二天就能给出诊断。他说，要使rWGS诊断工作流在现实世界中广泛应用，“更重要的是可伸缩性和成本，而不是速度。”
他特别指出，斯坦福大学的研究没有讨论错误率，这是纳米孔测序长期以来的一个问题。他还指出，论文中提到的估计成本为每位患者4971美元至7318美元，大大高于他的团队约1500美元的成本。
此外，Kingsmore还表示，他“不确定”云计算是否会在获得CLIA认证时出现问题，而CLIA认证是该技术用于临床诊断的必要步骤，因为这是认证机构“不习惯处理的事情”。vwin德赢ac米兰合作
阿什利目前拒绝透露测序错误率，称即将发表的一篇技术论文“包含了我们所有的基准测试数据”，并将在下个月发表。他还表示，他“不担心”CLIA的认证，并补充说，“计划是绝对继续下去。”
耶鲁医学院医学遗传学主任、教授蒋永辉说，斯坦福大学的成就“相当令人印象深刻”。虽然他也担心基于纳米孔的rWGS的误差率，但他说，在决定如何对生命处于危险中的患者进行侵入性治疗时，这种速度可以为床边医生提供帮助。
2019年，耶鲁大学还开始为使用Illumina平台的危重患者提供rWGS。但是根据Kingsmore的说法，不同于Rady一个月对大约100名患者进行测序，耶鲁的操作规模要小得多——每年分析大约30名患者的基因组。尽管耶鲁大学的患者测序费用由医院系统承担，蒋估计rWGS的成本在每个患者5000到10000美元之间，与斯坦福大学的水平相当。
蒋还指出，虽然测序的材料成本可以很低，但“软成本”，包括数据分析、物流和人力，可能是巨大的。Jiang说，其他医院要效仿斯坦福大学破纪录的速度，还需要实验室技术员、生物信息学家、遗传顾问或临床遗传学家24小时待命，以避免延误，这是临床遗传学专业人士需要考虑的问题。“我们不会在半夜叫醒人们去查看DNA序列，”他说。“这不是目前的典型做法。”
阿什利表示同意。“基因组实验室准备好全天候运转了吗?”他说。“我认为他们不是。”重症监护室的工作人员希望白天和晚上都在那里工作，他补充说，“但如果你在基因组实验室工作，你会惊讶地发现，目前要求你在夜间工作。”
Jiang和Kingsmore还指出，除了测序和生物信息学，注释致病变异有时可能很耗时，阻碍了快速诊断。金斯莫尔说:“我们需要专家实验室主任和遗传顾问进去，在测试结束后，他们可能需要10个小时。”“所以，这是一个真正的瓶颈。”
加州大学戴维斯分校(UC Davis Health)精准基因组项目主任Suma Shankar医生表示，斯坦福大学团队描述的超快速纳米孔WGS方法“非常棒”，“可以为代谢患者带来不同”，对这些患者来说，护理管理是关键。
作为的一部分项目熊宝宝该项目由Rady Children 's于2018年发起，目的是证明rWGS在快速诊断患有无法解释疾病的新生儿方面的价值。UC Davis并不提供内部rWGS，而是将样本寄给Rady。
尚卡尔说，她的病人使用rWGS的费用可达7000到10000美元，因此，她认为斯坦福大学对纳米孔测序的成本估算“实际上相当不错”。
她指出，斯坦福大学的研究人员没有对儿童参与者的父母样本进行测序，而这对于确定致病变异是如何分离的或它是否是一种新创事件,她解释道。
尚卡尔还强调，无论测序平台是什么，rWGS“对整个家族乃至整个家族以外的人都有影响”，因为这项技术可以破译整个基因组。因此，她说，知识渊博的临床医生或医学遗传学专业人士“需要进行适当的同意和咨询”，这需要时间。
尽管如此，她说斯坦福大学的成就对社区来说“非常令人兴奋”。“2002年至2005年，我是一名研究生。我们正在进行凝胶试验，并讨论有一天我们会抽血，进行测序，并在数小时内得到答案。”尚卡尔回忆道。“我认为这一天已经到来了。”