纽约——瑞典卡罗林斯卡研究所开发的一种新方法为同一单细胞提供了全基因组测序和转录组学，在癌症研究和基因筛查方面具有潜在应用价值。
直接核标记和RNA测序(dnr -seq)是由卡罗林斯卡癌症研究人员Martin Enge开发的一种基于平板的方法，它结合了低覆盖率测序和SMART-seq (RNA模板测序5'端切换机制)。
在周四发表的一篇论文中分子细胞， Enge的团队描述了这种方法，并提供了概念证明，DNTR-seq产生的库位置偏差比典型的纯dna方法更低，同时以更少的读取量实现相同的覆盖广度。平均而言，每个单元格的库总大小为2.48 gb。
作者写道，由于读取的位置偏差低，该方法特别适合调用拷贝数变体(CNVs)。在一项实验中，研究人员能够从白血病患者的冷冻样本中根据CNVs识别出较小的亚克隆。
整个文库的制备都在一个微孔内进行，进行一次PCR扩增和三个酶解步骤，中间不需要清除。在每个细胞约100万次读取的超低覆盖率下，每个样本成本的80%是测序成本。Enge说，这种方法很容易识别经常困扰单细胞转录组学研究的双染色体。“由于我们直接切割基因组模板，我们可以很好地了解有多少条染色体，”他说。
东芬兰大学(University of Eastern Finland)的基因组学研究员Merja Heinäniemi说，这篇论文展示了一次分析数千个细胞的能力。他与Enge在癌症研究方面有合作，但没有参与这项研究。尽管基于液滴的单细胞RNA-seq方法重新定义了所谓的高通量，DNTR-seq被证明是有用的:“即使没有大量的细胞，他们也获得了很多见解，”她说。她指出，低覆盖率测序通常不会产生单核苷酸变异的数据;然而，用DNTR-seq分析约60个克隆细胞组，在100万个每对37 bp的读对深度时，召回概率约为80%。
此外，“看起来你可以在任何实验室里进行实验，”她说。“这也使它具有吸引力。”
Enge说:“我们的主要重点是研究肿瘤中不同类型细胞的行为。”“我们希望能够了解不同突变的转录效应，但也要确定肿瘤中存在哪种细胞类型。”但他说，这种方法也可以应用于基因筛选和细胞成熟研究。
Enge将DNTR-seq的起源追溯到他在斯坦福大学Stephen Quake的实验室做博士后的时候。他说:“那时我们主要研究RNA-seq数据。”他说，单独的RNA数据提供了基因组的一个不完整的视图，而与癌症的合作使获得DNA数据与转录组配对变得更加必要。使用DNTR-seq，“我们可以从病人身上提取组织，将其分离成单个细胞，并了解其中存在哪些不同的克隆体。对于每个细胞，我们可以了解它在组织中的表型。”
Enge的方法是对单细胞同时进行基因组和转录组分析的最新方法。基因组和转录组测序，于2015年推出，也将DNA和mRNA分离进行单独处理，使用多重置换扩增来扩增整个基因组。与此同时,DR-Seq，基于拟线性扩增，不分离核酸。
但Enge说，现有的方法“既费力又昂贵”。“为了获得吸引力，你必须能够做很多细胞。否则，还有什么意义呢?”
DNTR-seq从荧光激活的细胞分选器开始，它在板的每孔中沉积一个细胞。裂解缓冲液使细胞核保持完整，然后将其旋转下来，用自动移液器将其从阱中移出。
该方法在去除染色质处理后，使用基于标记的方法来制备测序文库，而不是随机启动和链位移。全基因组测序的DNA产量可达60%。然后在低覆盖率的情况下将样本汇集和测序。
留在孔中的转录组用SMART-Seq2协议．他说，RNA-seq的产量更难确定，但已公布的估计是大约20%到25%的mRNA。
WGS的样品准备费用约为$。每个细胞50美元，第一次低覆盖率通过测序的成本约为1美元。Enge说，SMRT-seq2的成本各不相同，可以在$。每个手机50美元2美元。
“我们的渠道通常是从WGS开始的，”他说。“这是一种更简单的协议，在基因组水平上描述大量细胞，然后选择细胞进行rna测序，成本更低。”
虽然对克隆的综合分析可以提供一些关于snv的见解，“目前的基本障碍是我们不能真正信任我们发现的单核苷酸变体，”Enge说。“我们从一个模板开始，很难区分早期轮PCR的错误。”他的团队正在研究纠正错误的方法来解决这个问题。
Heinäniemi注意到论文中提出的一项研究使用了冷冻的急性淋巴母细胞白血病细胞。这是她与Enge合作研究的一种疾病，希望DNTR-seq可以产生数据。
“我们打算在这些原代患者细胞中分析遗传与转录组的影响。我们非常感兴趣是什么决定了对治疗的反应，”她说。“当你患癌症时，这种反应可能与耐药性突变有关，也可能与RNA谱中的基因表达模式和特征有关。”
癌症疗法的目的是根除癌细胞，所以理想情况下，剩下的癌细胞数量很少。她说:“你现在可以用单细胞方法做的事情是，我们非常有兴趣尝试这种方法，巧妙地对培养皿上剩下的细胞进行分类，并对它们进行详细分析。”