纽约(GenomeWeb) -来自美国和英国的一个公私合作团队成功地利用组织活检和循环肿瘤DNA的外显子组和靶向扩增子测序来表征乳腺癌患者肿瘤的基因组结构，并跟踪其对各种治疗的克隆进化。
虽然这项工作仍需要在更大的队列中重复，但它确定了特定的体细胞突变组，当使用ctDNA监测肿瘤负荷、指导治疗或跟踪癌症患者的治疗反应时，这些突变可能是理想的。然而，研究结果也强调了目前在临床应用中使用ctDNA的一些潜在缺陷。
Muhammed Murtaza是转化基因组学研究所非侵入性诊断中心的助理教授和联合主任，在本月早些时候在德克萨斯州奥斯汀举行的分子病理学协会年会上，由RainDance Technologies赞助的一场演讲中介绍了这项研究的结果，RainDance Technologies的基于液滴的靶向测序平台是这项工作的组成部分。这项研究的结果是同时的发表在自然通讯．
目前已经发表了大量关于ctDNA在患者血液中作为诊断和监测实体肿瘤方法的潜在用途的研究。然而，在为这一应用建立证据基础时，检查肿瘤和血浆样本之间一致性的研究通常比较单个突变，并专注于单个肿瘤活检，忽视了克隆异质性的问题。
为了解决这个问题，Murtaza和来自英国癌症研究剑桥研究所、剑桥大学、Illumina和其他地方的同事几年前开始合作，将全外显子组测序应用于癌症患者的ctDNA，以阐明获得性治疗耐药性。他们努力的第一个结果是发表在自然2013年而且由基因组网覆盖．
“2013年的论文实际上证明了血浆DNA外显子组测序的原理，表明随着时间的推移，跟踪克隆进化是可能的，”穆尔塔扎在研究过程中从剑桥研究所加入TGen，他告诉GenomeWeb。“那篇论文假设血浆中所有不同的肿瘤样本都有一个公平的代表。我们在2015年的论文中所做的就是试图用一些经验数据来解决这个假设。”
在这项新研究中，Murtaza及其同事分析了一名雌激素受体阳性、人表皮生长因子受体2阳性转移性乳腺癌患者的8个肿瘤活检组织和9个血浆样本，该患者接受了连续靶向疗法——他莫昔芬和曲妥珠单抗，随后是拉帕替尼——超过三年。
他们使用Rubicon Genomics公司的ThruPLEX-FD全基因组文库对肿瘤活检样本进行了全外示子组测序，并在Illumina公司的HiSeq 2500平台上进行了分析，同时使用RainDance公司的ThunderBolts Cancer Panel和Illumina公司的MiSeq对血浆DNA样本进行了靶向扩增子测序。
Murtaza指出，RainDance的靶向测序技术提供的深度测序覆盖是这项研究的一个关键方面。vwin德赢ac米兰合作
他说:“在这项特别的研究中，我们对几个肿瘤和血浆样本进行了全外显子组测序，以真正获得该患者所有不同样本的突变广度。”“一旦我们有了那组突变，我们就使用RainDance的一种开源方法，对为这个特定患者设计的一组定制的PCR扩增子进行深度测序。这使我们能够真正深入测序，[并]对等位基因部分的变化进行相当准确的评估，以及验证我们从外显子组测序数据中调用的这些突变。”
测序工作发现了207个功能性突变，该小组从中确定了8个主要突变簇，基于等位基因片段的变异，由PyClone支持的贝叶斯聚类确定，PyClone是几个研究人员开发的信息学包，用于肿瘤活检和连续移植的肿瘤异种移植的突变分析。
Murtaza解释说:“从对单个患者的详细研究中观察到的一个结果是，ctDNA和肿瘤活检之间的体细胞突变的一致性可以根据每个突变在癌症系统发育中的位置来确定。”
他补充说:“当我们在(肿瘤样本)中验证207个突变，并用靶向测序对它们进行深度测序时，我们发现突变分为不同的组。”“我们在所有肿瘤样本中都发现了一些突变，而且含量很高，所以这些突变可能发生在癌症系统发育的早期。”该小组将这些突变称为茎突变或截尾突变。
另一组突变丰度很高，在所有转移性肿瘤样本中都很容易检测到，但在原发肿瘤或淋巴结活检中不太容易检测到。穆尔塔扎说:“这就是我们所说的转移性支突变。”“如果你愿意的话，这些可能是转移性肿瘤样本最新的共同祖先。”
第三组突变，称为私有突变，相对来说是多样化的，因为它们基本上分散在每个肿瘤活检中。
总的来说，研究人员能够证明ctDNA含有反映不同肿瘤亚克隆的大小和活性的体细胞突变。此外，他们在论文中写道，分析这些突变“反映了从多区域肿瘤测序中确定的克隆层次，并跟踪了跨转移的不同治疗反应”。
这项研究的关键发现之一是，所谓的截断突变可能是监测肿瘤负荷的最佳候选者，因为它们在循环水平中最高，在随访期间不太可能消失。
穆尔塔扎说:“当你评估特定突变的ctDNA和肿瘤样本之间的一致性时，缺乏一致性可能意味着许多不同的事情，包括ctDNA水平太低，或者你看到的突变并不代表完整的肿瘤。”“我认为这是今后需要牢记的一个关键方面。基于这些结果，我们建议，如果你在跟踪肿瘤负荷，你会想要为你正在观察的肿瘤选择一个截尾或茎的突变，因为这真的代表了肿瘤负荷及其变化情况。”
该研究的另一个警告是，ctDNA分析可以发现不一定代表所有实体肿瘤的突变，这可能会让临床研究人员失去线索。例如，研究人员在血浆中发现了11个高置信snv，在任何分析的肿瘤活检中，这些snv在超过2%的等位基因分数下都无法检测到。
其中包括PIK3CA的一个热点突变，在曲妥珠单抗和他莫昔芬治疗期间，在血浆中鉴定出的等位基因分数为3.5%，但在拉帕替尼治疗开始后，降至约1%，然后变得无法检测到。
穆尔塔扎说:“这是我们在血浆中发现的一种可操作的突变……但它低于干细胞突变的整体循环丰度。”“这种突变在乳腺癌中经常出现。这是一个可操作的突变，但很明显这个突变在病人身上存在异质性。因此，在乳腺癌中可能是驱动突变的因素似乎是相当多样化的，并没有真正发挥重要作用。”
穆尔塔扎总结道:“我希望这篇论文能让人们意识到，在进入临床之前，在这一领域还有很多工作要做。”