纽约——1月底，范德比尔特大学的抗体研究员詹姆斯·克罗(James Crowe)正准备进行一项测试，以开发针对病毒爆发的潜在抗体疗法。
目标是:在60天内完成，这是由美国国防高级研究计划局(DARPA)设立的一个项目设定的标准，该项目为克罗和全国其他三个实验室提供了资金。
克罗的实验室在去年的一个测试场景中接近成功，他们能够产生针对寨卡病毒的抗体，并在短短78天内在灵长类动物身上证明了它们的有效性和安全性。
和2019年的预演一样，2020年的预演也应该是模拟演习。但随着SARS-CoV-2病毒开始在美国出现——第一例来自西雅图的病例于1月20日通过RT-PCR检测得到确认——克罗从他的DARPA项目官员那里得到消息，这不再只是一次演习。
克罗说，他的实验室收到了美国一号患者的样本，就在他们被确诊感染COVID-19一周多后。虽然从那时起已经过去了60多天，但范德比尔特实验室以惊人的速度找到了已经与IDBiologics和阿斯利康两家公司合作开发的候选抗体疗法。位于佛罗里达州的国防部承包商Ology Bioservices也获得了1400万美元，用于开发和制造克罗实验室和其他调查人员发现的抗体。另外两家公司正在调查范德比尔特的抗体序列许可，但克罗拒绝透露。
“微流体单细胞分选和高通量NGS。这确实是两项使能技术得以实现的技术，”美国国防部高级研究计划局负责大流行预防平台(P3)项目的官员艾米·詹金斯说。她说，其他的抗体发现方法，包括杂交瘤，可能需要一年或更长时间才能产生一种候选药物。克罗补充说，合成生物学和蛋白质工程的概念对他的实验室的成功至关重要。“所有这些东西都在一起。它使我们能够快速、大规模地工作。”“因为这是一个随机过程，你搜索得越多，得到的(抗体)克隆就越好。”
克罗赞扬了几家特定的基因组学和合成生物学公司和技术，使他的实验室能够如此迅速地完成工作。他说，10x基因组公司和细胞分选公司伯克利光都不遗余力地确保范德比尔特大学有必要的仪器来分离产生抗体的B细胞。下一代测序技术来自Illumina和vwin德赢ac米兰合作太平洋生物科学帮助确定了重建这些抗体编码基因所需的序列，该实验室使用Twist Bioscience的合成DNA平台完成了这一工作。该实验室还集成了Beckman Coulter的自动液体处理和使用Illumina的BaseSpace Sequence Hub的数据分析。
克罗说:“对于COVID-19的工作，我们并行进行了10或12个不同的工作流程。“我们做了很多不同的事情。有些有效，有些无效。这有点像即兴创作。”
基本过程包括筛选血液样本中所有可用的细胞，直到只剩下产生抗体的记忆B细胞，这些B细胞约占白细胞的5%。每10000个B细胞中只有1个会产生针对病毒的抗体。
由于单细胞分析仍然很昂贵，实验室经常用流式细胞仪对B细胞悬浮液进行预富集。实验室使用10x的铬单细胞分析仪与免疫分析套件或伯克利灯的信标仪器分离细胞进行NGS分析。对于快速反应平台，测序是在Illumina的平台上完成的，尽管太平洋生物科学公司的单分子长读平台也用于某些阶段。有了抗体生成序列，实验室使用Twist Bioscience的合成DNA平台生成数千个结构，然后在生成抗体蛋白质的细胞中表达。克罗说:“在某种程度上，我们把抗体和病毒蛋白混合在一起，这时我们才真正知道发生了什么。”
为了应对冠状病毒，范德比尔特实验室与10x Genomics和Berkeley Lights合作，获得了他们需要的仪器。刚开始的时候，他们只有一台铬仪器，位于生物安全二级实验室。为了研究这种病毒，他们需要将该仪器转移到BSL-3实验室，并获得另一台用于低风险工作的仪器。
自去年以来，由于美国联邦法院颁布了一项禁令，禁止10x销售与较老的GEM微流控芯片兼容的铬仪器，该禁令是Bio-Rad实验室成功提起的专利侵权诉讼的一部分。范德比尔特大学的研究人员已经在这些老芯片上验证了他们的工作流程。
克罗说:“我说，‘天哪，我们没时间把所有东西都重做了。到2月中旬，已有10家公司上市获得许可Bio-Rad和法院提供了一个遗留的铬仪器。
同样，伯克利照明与实验室密切合作，将他们的Beacon仪器纳入他们的工作流程。“我们一直计划合作开发病毒抑制试验，但我们没有Beacon仪器，”Crowe说，“而且不可能将我们的研究转移到加利福尼亚。”Berkeley Lights公司将一台借来的仪器带到纳什维尔，并派出应用专家留在现场与范德比尔特团队一起工作。
该平台可以将活细胞放入“笔”中，并对它们进行短时间的观察。克罗的团队能够观察到细胞分泌的抗体，这些抗体随后阻断了添加到笔中的SARS-COV-2刺突蛋白。“能够做到这一点非常新颖，”他说。“我们必须在大流行期间迅速解决这个问题。”
大多数的NGS分析都是用Illumina完成的，特别是当只观察抗体序列的可变区域时。但有时实验室想要看到基因和抗体异型的多态性，这需要PacBio的长读取能力。克罗说，这个平台对“我们知道自己喜欢的抗体也很有用，可以找到我们想要生产和永久使用的真实序列”。
克罗还指出，忒斯特的DNA合成是工作流程的“一个重要组成部分”。(Twist公司有自己的COVID-19抗体发现项目，并在本月早些时候宣布，它已经发现了针对SARS-CoV-2的竞争性抗体，以及与病毒主要用来感染细胞的人类ACE2受体结合的抗体。)
虽然范德比尔特的发现是成功的，但仍有改进的空间。单细胞技术可以回收10%到60%的抗体基因。克罗说，虽然这不是技术上的限制，因为人体有时需要几个月的时间才能对一种病毒产生强有力的免疫反应，但最有希望的抗体来自于实验室直到3月中旬才收到的患者样本。但这也意味着，在实验室将接力棒交给临床试验研究人员之前，只需要五到六周的时间。现在，他的实验室正在支持他们的合作伙伴将抗体通过临床试验，尽管他们可能很快会对COVID-19进行新一轮的发现。
P3项目经理艾米·詹金斯说，范德比尔特并不是唯一的成功案例。“有些人可能会比其他人提前一点，但他们通常都在几乎相同的时间范围内发现抗体。”其中包括阿斯利康(AstraZeneca)，该公司也有自己的发现平台;总部位于温哥华的抗体治疗公司AbCellera与礼来公司合作开发COVID-19抗体;以及杜克大学医学院的人类疫苗研究所。詹金斯说，美国政府保留使用DARPA资助的技术的权利，但P3的任何治疗方法都将向平民和国防部开放。此外，国防部与Ology Bioservices的合同是“我们确保获得其中一些产品的一种方式，”她说。
最终，詹金斯希望看到基因组学在通过基因构造将抗体运送到体内的过程中发挥作用。“这是非常困难的，可能比找到它们还要困难，”她说。“希望我们会成功的。”