约翰霍普金斯大学的研究人员描述了一种非侵入性产前三体诊断的新方法，该小组认为比其他基于测序的非整倍体检测方法更简单，更有效。
研究小组发表了纸在《公共科学图书馆•综合》上个月讨论了这种方法——一种被称为快速非整倍体筛选测试测序系统(Fast - seqs)的样本制备和测序方法。
据来自约翰霍普金斯大学基梅尔癌症中心路德维希癌症遗传学和治疗学中心的研究人员说，FAST-SeqS -使用单个引物对筛选和放大每条染色体上具有小而可识别差异的基因组部分-与目前需要更广泛的样本和文库制备的测序方法相比，提供了“显著提高的吞吐量和降低的成本”。
在一系列混合实验中使用这种方法，该小组报告说，它可以从正常样本中区分含有低至4% 21三体DNA的样本。研究人员目前正计划对人体进行试验，以更好地证明这项技术的潜力。
约翰·霍普金斯大学研究小组论文的第一作者艾萨克·金德告诉记者临床测序新闻虽然这篇论文只代表了该方法的最早测试，但该小组对其潜力感到兴奋。
“这些都只是在实验室里把东西混合在一起，所以绝对只是原理验证实验。我们还需要一段时间才能将其应用于临床。”“但我们认为这肯定是非常有希望的事情。”
几家公司最近通过对母体血浆中的DNA进行测序，开发了非侵入性检测胎儿非整倍体的先进方法。Sequenom是第一家将这种检测商业化的公司，2005年，该公司获得了香港中文大学(Chinese University of Hong Kong)的许可，将其方法用于检测母亲血液中的无细胞胎儿DNA。
此后，其他几家公司也进入了竞争激烈的市场，包括Verinata和Ariosa Diagnostics。Verinata的方法与Sequenom类似，Ariosa Diagnostics采用了更有针对性的方法。Sequenom在保护其知识产权方面采取了积极的立场，它认为这阻碍了其他公司开发基于非侵入性测序的胎儿非整倍体诊断技术。
今年1月，Sequenom对Ariosa提起了专利侵权诉讼。Ariosa、Verinata和另一家公司Natera都起诉了Sequenom。
在这种有争议的知识产权格局中，霍普金斯大学团队正在谨慎地推进FAST-SeqS的开发计划。“我们希望为(在这一切中)最好的情况做好准备。这就是我们的观点。”“如果该领域允许竞争，我们将做好准备，并将(我们的技术商业化)付诸行动。”vwin德赢ac米兰合作
金德表示，FAST-SeqS方法源于该团队对癌症早期检测的研究，是该团队去年开发的一种名为Safe-SeqS的技术的改进，用于检测和量化罕见突变(CSN 6/1/2011）.
“我们意识到这种计数分子的技术可以应用于非侵入性三体检测。这就是思考过程的开始。”
“我们实验室经常考虑的另一件事是如何将一项技术转化为在临床中有用的东西。所以简单、高效，这些都是我们经常考虑的问题。”
Kinde解释说，FAST-SeqS比目前的母体血浆DNA测序方法简单得多，其样品制备方法也有很大不同。
在Sequenom和Verinata的案例中，“他们以公正的方式从整个基因组中提取DNA片段，无论是母亲还是胎儿。然后他们将其与基因组进行比对并进行计数，”他说。与此同时，在Ariosa方法中，“他们实际上将特定的寡核苷酸杂交到他们想要量化的每个区域。”
但他说，无论哪种情况，“最终结果都是一样的。你有来自基因组不同区域的不同DNA片段，你在染色体表示方面寻找差异……在这两种技术中，准备样本涉及很多步骤。”
金德说，霍普金斯方法的优势在于预先测序步骤的简单性。
FAST-SeqS包括使用引物对进行PCR扩增，该组设计用于杂交整个基因组的许多不同区域，包括“每个核染色体”，金德解释说。
他说:“我们希望得到相同的结果，即拥有来自许多不同染色体的DNA片段，但不需要所有步骤。”
“我们的想法是，如果你能找到一个基因组中非常小的区域，这些区域与不同染色体上的其他区域非常相似，但不完全相同……你可以设计引物，在整个基因组中不改变的位置围绕这些区域，但在这些引物之间有微小的差异，这将提示我们这是来自一条染色体还是另一条染色体。”
金德说，研究小组一开始寻找21号染色体上的小区域，他们知道这是他们的目标，并以“强力方式”观察是否有150个碱基对的序列块可能符合要求，最终缩小到三个，为它们设计引物对，然后再次缩小到一个表现最好的引物对。
一旦研究小组有了引物，他们就开始测试这种方法。研究人员首先研究了来自7名正常女性的8个血浆样本，以确定测序方法不会产生假阳性——在这种情况下，所谓的z分数比平均值高出三个标准差。根据金德的说法，z得分为3的临界值是一个广泛使用的标准。
在测试中，研究人员发现，在8个样本中，第21、18和13号染色体的最大z分数分别为1.3、1.4和1.0，明显低于临界值。
接下来，研究小组在另外8个样本中重现了这种情况，这次是白细胞。金德说:“我们看到了同样类型的可重复性。”“样本中没有一条染色体大于3或小于负3。”
金德说，该小组在前两个实验中使用了Illumina HiSeq 2000。然后，他们用Illumina GAIIx的半车道检测了第三组8个样本。“我们每个样本得到的标签更少，”金德说——根据该小组的论文，测序几乎少了三倍——“但数据仍然是可重复的。没有任何异常，”他说。
总的来说，他说，“这是第一次真正表明这项技术将是可用的，因为在正常样本中，它不会产生假阳性。当然，这也可能意味着它根本行不通……但这就是我们的出发点。”
随后，研究人员进一步确定该方法可以识别非整倍体，首先测试了4个21三体样本，2个18三体样本和1个13三体样本，然后测试FAST-SeqS在越来越低的浓度下识别三体存在的能力。
“这很重要，”金德说，“因为如果我们希望能够检测出非整倍体胎儿，越早越好。你希望给这些家庭时间来准备他们是否要采取行动。”
金德说，在完整的三体实验中，研究小组发现z得分“高得惊人”，从32到56不等。
然后，该团队进行了混合实验。金德说:“在一项可以准确检测低水平和高水平三体的技术中，你应该看到的一件事是某种剂量依赖性。”“如果你将不同比例的样本混合在一起，三体DNA比例较高的样本应该比比例较低的样本给出更高的z得分。”
在这项测试中，研究小组评估了8个样本，这些样本来自一名三体患者的DNA和一份正常的DNA样本，以创建两个正常对照，两个样本含有5%的三体DNA，两个样本含有15%，两个样本含有25%。
金德说:“我们看到的比例和预期的差不多。”“你可以看到这条线与数据吻合。”
最后，研究人员测量了FAST-SeqS是否能在只有4%三体DNA的样本中识别出三体。金德说:“对于每一种情况，无论是0%，4%还是8%，我们都可以准确地将它们与正常值区分开来，所以这对我们来说是一个非常鼓舞人心的实验。”
金德说，在研究人员将这些初步结果应用于临床之前，他们必须在真实的怀孕中测试这种方法。目前，该团队正在决定如何最好地进行一项针对孕妇的大规模研究。
金德说:“我们正在考虑的一件事是，如果我们与一家已经有样本的公司或组织合作，并且我们可以快速完成，也许我们会进行回顾性研究。”“但也有可能我们可以与一个看到很多高风险怀孕的小组合作，并进行前瞻性试验。我们对任何一种都持开放态度。”
他说，最重要的是，该小组希望能够“尽快”将其方法应用于临床。
他说，如果能在未来几年内完成这样的研究，该团队将“非常高兴”。
据金德说，这种方法理论上可以与各种测序技术一起工作。他的实验室使用Illumina，因为这是研究人员最熟悉的，为了保持一致性，他们可能会在未来的大型研究中继续使用Illumina机器。
他说，使用MiSeq可以加快速度。“如果你想要进行最快速的测试，那么不需要把样本送出去可能会很好，所以实现这种测试的一种方法可能是利用MiSeq的能量和速度，这将为我们提供足够的测序深度，并且可以在许多实验室中进行。”
因为他们的方法减少了步骤的数量，“这是你可以开始考虑许多诊所自己实施的事情，”他说。“显然，必须准备一个工具包并进行标准化。但我们希望这足够简单，这样是可行的。”