利用纳米孔测序技术，哥伦比亚大学欧文医学中心的研究人员和他们的合作者开发了一种快速、低成本的检测方法，可以在多种生殖样本中检测胎儿非整倍体。
发表在新英格兰医学杂志本月早些时候，这项名为short-read transore快速核型分析(STORK)的测试可以在数小时内识别整个基因组的非整倍体，而每个样本的成本仅为200美元或更低。此外，测试的相对较低的设置成本使其适合部署在即时护理设置中。
“纵观整个生殖医学，存在着非整倍体这种灾难性的情况，即你有多余或缺失的染色体，”哥伦比亚大学(Columbia University)生殖内分泌和不孕症部门主任、该研究的首席研究员泽夫·威廉姆斯(Zev Williams)说。他补充说，由于非整倍体是迄今为止最常见的流产原因，能够快速、廉价地检测和诊断这种缺陷对生殖保健具有重要意义。
Williams说，传统的非整倍体检测方法是g带核型分析，在产前筛选过程中提取的细胞被培养，然后在显微镜下观察。然而，这种方法需要数周的时间才能得到结果，而且需要活细胞。
与此同时,荧光原位杂交(FISH)是一种分子细胞遗传学技术，它提供了一种更快速的方法来检测某些染色体异常，但这种方法的缺点是它不是全基因组的，只能针对有限数量的染色体。
Williams说，除了细胞遗传学，还有基于dna的方法，如染色体微阵列和下一代测序，用于非整倍体检测。然而，这些方法，就像核型分析和FISH一样，通常需要在高复杂性的测试实验室中进行，这些实验室在设备上进行了大量的前期投资。
威廉姆斯说:“所有这些方法都需要你取一个样本，然后把它送到一个集中的参考实验室。”“我们意识到，如果你能得到快速和低成本的东西，那将真正改变患者的游戏规则。”
为了实现这一目标，该团队试图开发一种使用纳米孔测序的检测方法，这提供了牛津大学纳米孔MinIon技术，一个低前期仪器成本。为了提高测试速度，该团队试图进行短读测序。
“对于我们的应用程序，我们实际上不需要长时间的读取;长时间阅读实际上是浪费时间，”威廉姆斯解释道。“我们的方法是这样工作的，你可以把它看作一种计数方法，而不是排序方法。我们只需要知道那一小段DNA的身份。”
也就是说，Williams指出，该团队在方法开发过程中需要克服的最大技术瓶颈是调整纳米孔测序平台，该平台针对短DNA片段进行了长读测序优化。
“基于纳米孔的测序是为长读测序而开发的，”他说。“有趣的是，最难的部分不是制造小DNA，而是如何处理这些DNA，让纳米孔测序器能够读取它。”为了解决这一瓶颈，Williams说团队必须设计方法让纳米孔测序“更有效地”读取短DNA片段。例如，其中一种策略是用0.4 pmol左右的短读库加载流池，这比制造商推荐的加载条件多生成30%多的测序数据。
在他们的研究中，Williams和他的团队将STORK应用于218个盲育生殖样本，这些样本包括自然流产后的妊娠产物、绒毛膜绒毛取样的组织、羊膜穿刺术的羊水和胚胎着床前基因检测的滋养外胚层活检标本。样品经基因组DNA提取和短读文库制备后，使用Oxford Nanopore MinIon flow cell进行测序，并使用指定算法对结果进行实时分析。
总的来说，数据显示STORK结果与所有样本类型的标准临床测试结果高度一致。在速度和成本方面，该研究表明，当测试单个样本时，测序时间可以压缩到10分钟，成本为200美元。当10个样品同时多路复用测序时，测序时间为2小时，成本低于50美元/个。
关于纳米孔测序准确性的潜在担忧，Williams说，因为STORK使用了类似计数的方法，序列只需要足够精确，以显示基因组中的reads对齐位置。他说:“我们试图利用这项技术的优势，即它的速度、低成本、便携性和易用性，但不必利用它在准确性方面的局限vwin德赢ac米兰合作性。”
加州大学旧金山分校(University of California, San Francisco)的妇产科教授、加州大学旧金山分校(UCSF Health)的首席基因组学官亚历山大·拉杰科维奇(Aleksandar Rajkovic)说，这种方法“非常令人印象深刻”。“只要你缩短了从样本收集到诊断的时间，你就在进步。”
据Rajkovic说，目前广泛用于检测非整倍体的核型分析和染色体微阵列分析通常需要7到14天才能完成。他说，核型分析往往不能为产前样本提供高分辨率，而且由于培养步骤的原因，它可能会遗漏某些细胞类型。“当你培养细胞时，你可能会失去某些细胞群，”Rajkovic说。“你可能有正常细胞和异常细胞的混合物，而异常细胞可能无法正常生长。”
Rajkovic还认为，在产前环境下，提高的检测速度可以帮助妇女或夫妇减轻他们在怀孕期间对非整倍体的担忧。“如果你能让他们放心，至少在染色体层面上，一切都很好，”他说，“这就会非常令人放心，可以减少夫妻之间的焦虑。”他补充说，在提供可操作的信息方面，更快的检测结果可以让患者更快地决定他们想如何管理自己的怀孕。
Rajkovic指出，STORK的一个局限性是，因为它是基于计数的，它不能提供单核苷酸多态性(SNP)的信息，而SNP对于诊断单亲本二聚体或纯合性区域很重要。同样，他想看看STORK在检测微缺失和微重复方面有多好，他说这在论文中没有明确。
在评论新方法的成本时，Rajkovic认为它将如何转化为转移到病人身上的费用还有待观察。Rajkovic说:“无论什么时候你在临床环境中投入一些东西，你都必须支付生物信息学的费用，你必须支付技术人员的费用，这当然会增加成本。”“问题不在于它到底要花多少钱，而在于你要向病人收多少钱。”
除此之外，他说，最大的问题是保险是否会支付这次测试的费用。“产前检查的问题是，保险公司并不总是很好地报销产前检查，”他解释说。“染色体微阵列仍然没有得到很好的补偿;全外显子组和全基因组测序在产前不报销，因为保险公司认为这些信息不会改变妊娠过程。”
对此，威廉姆斯表示，该团队的目标是进一步降低测试成本。他说:“我认为我们应该能够以200美元以下的价格提供(这种检测)。”他补充说，希望降低的成本能让患者和临床医生不必对保险公司感恩戴德，就能得到答案。
加拿大生殖辅助技术生育中心(CReATe)生殖遗传学主任Svetlana Madjunkova说:“通过快速检测来确认非整倍体，大多数病例将得到诊断。”vwin德赢ac米兰合作“然后你就可以花时间为需要进一步评估的患者进行适当的全面测试。”
2020年，Madjunkova和她的同事也发表了一项研究在新英格兰医学杂志在那里，她的团队能够通过使用MinIon设备的纳米孔测序同时检测到胚胎中的结构重排和非整倍体。
Madjunkova的实验室自2016年以来一直在使用纳米孔测序，据她的团队和STORK之间的区别是，前者使用纳米孔长读测序，这也可以确定胚胎的平衡转移和重排。Madjunkova说，在周转时间方面，她的分析可以在几个小时内完成，这取决于样本的数量，而STORK可以在最短的10分钟内完成测序。
虽然CReATe生育中心目前提供基于纳米孔测序的临床测试，以选择患者帮助诊断结构重排，Madjunkova说，对于非整倍体测试，该设施主要回复在Illumina平台上的低通全基因组测序，以满足诊所通常每周超过1000个胚胎的高吞吐量。
她说，在Illumina测序的情况下，从文库准备到测序结果的周转时间约为24小时，另外还有几个小时用于生物信息分析。Madjunkova说，基于illumina的分析的成本约为每个样本200美元。
与哥伦比亚大学研究人员的观点一致，Madjunkova认为基于纳米孔的分析的主要优势是它们需要更低的前期资本投资，这使得小型实验室更容易获得该技术，而且它相对容易使用。vwin德赢ac米兰合作
因此，她认为基于纳米孔测序的非整倍体测试可以“填补空白”，因为那些实验室无法方便地进入集中参考实验室进行更全面的测试。Madjunkova还表示，这些检测的高速度也使它们更适合部署在护理点环境中。此外，她认为快速的检测周期还可以帮助经历过流产的患者获得解脱，减轻一些自责或绝望。
尽管Madjunkova认为纳米孔测序技术的快速发展令人兴奋，但她也指出，这在一定程度上给临床应用带来了障碍，因为这通常需要一个固定的工作流程。她说:“我可以证明，这是具有挑战性的，(尤其是)如果你想实现所有现有的新东西。”
然而，Madjunkova说，与任何临床测试一样，改进或改变协议可能会给临床实验室带来额外的工作，但这是必要的。她补充说:“我的哲学是，我们只会在看到更好的回报时才会移动或改变临床工作流程。”
与此同时，在哥伦比亚大学，威廉姆斯说他的团队正准备将STORK作为诊断测试提供给患者。他的团队已经为该测试申请了专利，并已将该测试提交给纽约州进行临床批准。
他说:“一旦获得批准，我们很高兴能够为患者提供这种药物。”