巴尔的摩——来自冷泉港实验室的研究人员开发了一种新的Cas9靶富集纳米孔测序方法，该方法有望提高靶上覆盖率和读取长度。
该方法被命名为基于亲和的Cas9介导富集(ACME)，建立在现有的纳米孔Cas9靶向测序(nCATS)方法之上，该方法此前由约翰霍普金斯大学温斯顿·蒂姆普的实验室开发。通过在nCATS中加入背景减少步骤，研究人员报告了增加目标测序深度和提高端到端读取长度的新方法。
冷泉港实验室W. Richard McCombie实验室的研究生、ACME的开发者Shruti Iyer说，nCATS方法是第一个使用纳米孔长读实现靶向测序的有效方法。但是，由于nCATS不包含背景缩减步骤，它产生目标和的池非目标她说，DNA片段引发了孔隙占用的竞争，减少了靶上读取的总体覆盖范围。
ACME“是对nCATS方法的修改和轻微改进，”Iyer说，他提出了新的方法，之前在一份预印本上BioRxiv，在本月初的今年基因组生物学与技术进展(AGBT)年会上。vwin德赢ac米兰合作“我们觉得我们需要一些东西来减少背景，让我们的目标有更多的机会被测序。”
机制上，ACME利用Cas9核酸酶(含有6-组氨酸标签)与非靶DNA片段在裂解步骤后结合。通过使用磁珠进行his - tag特异性的清除，研究人员能够从样本中拉出cas9结合的非靶片段，促进更多的靶DNA进入流细胞。
Iyer说，清理步骤在测序深度和读取长度两方面都产生了“巨大的差异”。她说，首先，靶上测序的覆盖率“全面”提高了，增加了两到十倍。
此外，她说，ACME支持跨越目标的单次读取，最长可达100kb，是nCATS读取长度的三倍。数据还显示，即使对于90 kb到120 kb长的目标，ACME也帮助捕获跨越整个目标的2到20个读取，而如果没有ACME，这些计数在0到2个读取之间。
Iyer说:“我一直对尝试为感兴趣的目标生成尽可能长的reads感兴趣。”他补充说，当覆盖大型基因目标时，更长的reads可以导致更大的tile，通过需要更少的Cas9引导，使映射更容易，可能降低测序成本。
研究人员进一步测试了ACME检测结构变异的能力，将其与太平洋生物科学公司、牛津纳米孔技术公司和SK-BR-3(一种常用的HER2+乳腺癌细胞系)的Illumina测序仪产生的全基因组测序数据进行比较。Iyer说，他们的想法是看看ACME是否能够在这些全基因组数据集中的目标区域内检测到sv。
结果表明，ACME检测到了PacBio和Oxford Nanopore全基因组测序之前确定的靶点内的所有15个sv。
类似地，该团队比较了ACME使用三个SK-BR-3全基因组数据集识别单核苷酸多态性的能力。他们发现，当将长读平台与Illumina (SNP检测的金标准)进行比较时，ACME的表现与全基因组PacBio和Oxford Nanopore测序数据相当。
然而，Iyer说，需要注意的是，ACME的初始基准测试使用了20 μg她所谓的“池DNA库”，这是从四个并行的ACME制剂组合而来的。她承认，在现实应用中，特别是对罕见或肿瘤样本，不太可能获得20 μg的DNA。
为了解释这一点，她还研究了ACME的性能，使用所谓的5 μg DNA输入的单样品制备。她说，在最初的几轮富集实验中，DNA输入的减少导致了覆盖范围和全长读取的下降，特别是对一些较长的目标。
然而，Iyer表示，在从旧的Cas9化学试剂切换到Oxford Nanopore于2020年底发布的全新独立Cas9试剂盒后，该团队看到了ACME性能的提高，测序覆盖率“非常接近”他们过去使用DNA样本池实现的效果。
在sv方面，Iyer说，使用5 μg DNA和古老的Cas9化学物质，该团队能够检测出PacBio和Oxford Nanopore全基因组测序发现的15种sv中的12种。随着新的独立试剂盒提供了更高的覆盖率，Iyer说她希望找到其他三种输入DNA量更低的sv。
虽然ACME可以帮助减少脱靶背景，但与nCATS相比，ACME需要更多的起始DNA, nCATS需要大约3 μg的输入DNA。Iyer指出:“这绝对是需要记住的。”他补充说，研究小组希望将DNA输入量降低到3 μg以内。
nCATS的开发者Timp说，ACME让nCATS“更进一步”，不仅丰富了感兴趣的目标，还删除了没有被瞄准的领域。他补充说vwin德赢ac米兰合作，这项技术对那些希望在定向长读测序过程中减少脱靶读取的研究人员特别有用。
除了像nCATS和ACME这样的靶向连接方法，Oxford Nanopore最近发布了一种所谓的自适应采样功能，通过在测序过程中对感兴趣的区域进行选择性测序，实现了软件控制的富集。
Timp指出，虽然像nCATS和ACME这样的方法通常有利于在10 kb到100 kb长的一打目标区域实现高覆盖率，但当涉及到大量目标时，自适应采样可能更适合。
“现在，如果我必须做很多区域，我可能会很快使用自适应测序，即使覆盖率较低，因为我只是不想经历(Cas9)指南的设计，”他说。他补充说，该领域仍然需要找到更好、更简单的方法来制作有效的指南，同时增加化验的多路复用能力。
Iyer说，ACME目前可以针对DNA样本中的11个区域，同时对所有目标保持良好的测序深度。她说，该团队计划继续扩大目标的数量，并指出挑战是确保导游不喜欢彼此冲突。
Iyer说，除了扩大靶点的数量，该团队的另一个目标是在同一个流细胞上实现多个样本的测序。为了实现这一目标，研究人员正在探索使原生条形码与ACME化学兼容的最佳方法。
她说:“如果在流式细胞中有更多的样本，测序的成本也会降低。”“这是我们正在积极研究的问题。”