巴尔的摩——来自东京科学大学的研究人员和他们的合作者开发了一种新的cDNA扩增和测序技术，与现有的方法相比，该技术有望提高单细胞RNA测序的效率。
该方法被称为终止子辅助固相cDNA扩增和测序(tasseq)，建立在之前的scRNA-seq方法的基础上，该方法利用模板无关的末端转移酶，利用纳米孔珠为基础的平台进行固相cDNA扩增。据报道，通过利用二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)在cDNA合成过程中实现随机终止，TAS-Seq可以减少末端转移酶反应的技术难度，获得具有高灵敏度和准确性的scRNA-seq数据。
东京科学大学的研究人员Shigeyuki Shichino在发表在该杂志上的一项研究中描述了tasa -seq方法，他的团队描述了该方法通信生物学上个月，他在一封电子邮件中写道。
据Shichino介绍，TAS-Seq最初是为了帮助他的团队为之前的一个项目获取更精确、更深入的scRNA-seq数据，该项目始于2017年，旨在构建多个炎症组织的单细胞图谱。
目前，许多广泛使用的scRNA-seq方法，如10x Genomics Chromium平台和Smart-Seq2，采用模板切换反应进行cDNA合成，其中使用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(mmlvrt)和模板切换寡核苷酸(TSO)合成第二条cDNA链。
然而，Shichino说，基于模板切换的scRNA-seq方法的效率可能会受到RNA模板5'结构的阻碍。为了解决这一问题，科学家们此前开发了包括Quartz-Seq和Quartz-Seq2在内的方法，通过使用一种称为末端转移酶(TdT)的模板独立聚合酶，将均聚物尾部添加到cDNA的3'端，从而避免模板切换。
不过，由于TdT的复杂性质，目前基于TdT的scRNA-seq方法的一个缺点是，它们需要严格控制TdT反应条件——包括反应时间、温度、引物量和酶活性——以抑制自由RT引物产生的过量副产物，Shichino补充说。
为了克服这一挑战，Shichino的团队开发了as - seq，它可以在外切酶i处理过的BD Rhapsody磁珠上进行固态cDNA合成。Shichino指出，通过增加ddNTP，特别是二脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)， TAS-Seq可以有效抑制TdT酶对聚c尾巴的过度伸长，消除了对TdT反应严格的温度和时间控制的需要。
为了测试TAS-Seq的性能，研究人员将该方法应用于小鼠和人类肺样本。结果表明，TAS-Seq得到的scRNA-seq数据与流式细胞术数据“高度相关”。此外，与常用的scRNA-seq方法如10X Chromium和Smart-Seq2相比，TAS-Seq在重要的细胞-细胞相互作用和生长因子方面表现出“更高的基因检测灵敏度”和“更稳健的检测”。
Shichino说，该团队还使用人类外周血单个核细胞在内部测试了TAS-Seq的批处理效应。根据他的说法，结果表明不同实验之间的批处理效应“非常有限”，在分析数据集时不需要批处理效应校正。
此外，研究人员还表明，tasa -seq与基于抗体的细胞哈希技术兼容，在这种技术中，研究人员混合来自不同样本的细胞，这些细胞被低聚标记抗体标记，并在同一个scRNA-seq平台上分析它们，从而vwin德赢ac米兰合作允许在同一个scRNA-seq实验中进行样本复用。
洛克菲勒大学单细胞基因组学和种群动力学实验室主任Junyue Cao说，TAS-Seq是目前可用的scRNA-seq策略的“一个令人兴奋的替代方案”。
从这项研究来看，Cao说TAS-Seq的一个“关键改进”是它似乎有更高的RNA检测效率。他解释说，传统的scRNA-seq方法依赖于模板切换机制，通常需要在第一链cDNA合成过程中，逆转录反应一路传播到mRNA模板的5'端，从而使cDNA在下游扩增。然而，由于并非所有的反转录反应都能成功到达mRNA分子的末端，在实验过程中可能会有一些cDNA分子脱落。
相反，通过优化TdT反应的延伸长度，在独立于RNA模板的第一链cDNA末端添加了一个均聚物尾巴，Cao说TAS-Seq升级了现有的基于TdT的scRNA-seq方法，同时实现了更高的转录检测效率。
此外，Cao认为TAS-Seq与单元格哈希的兼容性是该技术的“另一个伟大特性”。vwin德赢ac米兰合作
除了TAS-Seq的承诺，曹说他还有一个问题是成本，因为他没有看到这种方法和其他常用的方法之间有“非常明显的”成本比较。
Shichino表示，as - seq的大部分成本来自BD Rhapsody磁珠的试剂成本。据他说，他的实验室通常每次运行分析2万个细胞，这需要成本日元BD Rhapsody的珠子是21万美元(约1530美元)，或者日元每个单元格10.5美元(约合0.08美元)。与10X铬的成本相比，这是介于日元13.1日元25美元。Shichino说，每个电池10到0.18美元)，TAS-Seq“稍微便宜一点”。
在与TAS-Seq兼容的样本类型方面，Shichino说，由于该方法依赖于珠基纳米阱scRNA-seq平台进行细胞分离，因此输入材料仅限于活细胞、细胞核或非交联固定细胞，如甲醇固定细胞。
至于周转时间，典型的TAS-Seq工作流程通常需要三天，不过他说这在很大程度上取决于起始细胞的RNA数量。
展望未来，Shichino说他的团队正在对TAS-Seq工作流进行“广泛优化”，这是他们在发表的研究中没有做的。尽管该团队在检测到的基因数量方面已经将该方法的灵敏度提高了一倍，但他说需要进一步的研究来改善该方法的反应条件——包括缓冲成分、引物结构和DNA聚合酶——同时拓宽其应用范围。
最后，Shichino表示，该团队还试图将tasseq应用到其他固体支持单细胞平台，包括10X Genomics Visium。他补充说:“我们相信扩大TAS-Seq的应用可能有助于获得更深层次的单细胞多组学数据。”