这篇报道已经更新，以澄清scNT-seq和sci-fate的每个细胞成本。
来自宾夕法尼亚大学的研究人员描述了一种新的基于液滴的单细胞测序方法，用于识别新转录的rna。
建立在Drop-seq单细胞分析平台，该方法使用化学反应标记新的信使rna (mRNAs)与T到C取代。在今天发表的论文中自然方法研究人员报告说，他们能够对大约5.5万个细胞的转录组进行分析，划分出新的和旧的转录组。这种方法被称为单细胞代谢标记新RNA标记测序(scNT-seq)，使他们能够分析RNA的生物发生和衰变，并帮助解决细胞状态轨迹。
他们的技术加入了几种分析单细胞基因表达动态的基于板的方法，是今年发表的第二种方法，极大地扩大了这些实验可以进行的规模，到数万个细胞。
今年4月，华盛顿大学Jay Shendure实验室的研究人员描述了一种类似的测序方法组合索引．一项研究发表在自然生物技术vwin德赢ac米兰合作，作者使用了单细胞组合索引以及信使RNA标记(Sci-fate)来分析大约6000个细胞。据该研究的第一作者、现为洛克菲勒大学教授的曹君岳说，这种方法已经被用于分析大约1万个细胞，并可能被用于分析多达200万个细胞。
这些进展“通过增加时间维度，极大地提高了单细胞RNA-seq的效用”，使人们有可能看到特定基因的时间RNA动态，宾夕法尼亚大学教授、发表在《柳叶刀》上的这篇新论文的高级作者吴浩说自然方法．“你可以推断一个特定细胞的未来行为，而不是查看总的mrna的快照。”
“这表明你可以同时识别动态和稳态的基因调控网络，”他说。“你可以使用新旧RNA信息来推断细胞在几分钟到几小时的时间尺度上的未来状态。”
改进后的规模极大地降低了成本。对于scNT-seq，每个细胞的成本，包括测序，大约是$。50美元左右。仅图书馆准备工作就有10个;包括测序在内的Sci-fate大约是美元。每个单元10块，大约$。每个细胞的文库准备成本为05美元，但高度依赖于测序深度，曹说，可能会进一步降低。
这两种方法都能很好地与其他方法配合使用:曹说，sci-fate可以与Shendure实验室及其合作者开发的其他基于组合索引的分析方法分层，包括分析可获得的染色质或甲基化的方法。Wu的论文指出，scNT-seq可以与基因组编辑或化学扰动屏幕配对。
所谓的时间分辨RNA分析可以追溯到RNA-seq的出现。最简单的方法是错开分析，以便捕捉不同时间点的基因表达。另一种用于批量RNA-seq分析的流行方法是代谢转换，它用于scNT-seq和sci-fate。这种方法使用核苷酸类似物标记新创建的转录本，并将其与先前存在的转录本区分开来。这是4sU，一种胸腺苷类似物，在化学转化后会导致t - c碱基翻转。
几个欧洲的实验室已经开发了基于平板的单细胞方法，其通量在数百到数千个细胞，包括单细胞巯基烷基化用于RNA的代谢测序（scSLAM-seq)，新的转录组烷基化依赖单细胞RNA测序(NASC-seq)、5-乙基尿苷单细胞测序(scEU-seq)。根据sci-fate论文，scSLAM-seq和NASC-seq用于库准备的成本大约为每个细胞11美元。
结合化学转化是迄今为止阻止时间分辨RNA-seq出现在基于液滴的单细胞分析平台(如10x Genomics的Chromium和1Cellbio的基于inDrop方法的平台)的主要障碍。
Wu说:“在基于液滴的系统上封装之前，不固定地对这些细胞进行预处理是不可能的，所以我们必须在捕获这些rna后进行这种转换。”“你不能在逆转录后进行这种转换，这对其他微流体(单细胞测序)平台构成了挑战，在这些平台上，捕获和逆转录几乎同时发生。”
“我们只在液滴破裂后进行逆转录，这为珠上化学转化提供了一个完美的机会窗口，”他说。
科学命运研究小组在他们的论文中还指出原位4sU转化“需要细胞渗透，至少在我们的经验中，还需要多聚甲醛固定，这两种方法都不能直接引入10x Genomics等基于液滴的单细胞rna测序平台。”
另一种现有的方法是用算法对转录组快照排序，通常称为“伪时间”方法。但这些都是最好的猜测。“实际测量细胞如何从一种状态转变到另一种状态是非常重要的，”Wu说。
Sci-fate和scNT-seq使研究人员能够使用RNA速度，这是一种基因表达动态的定量测量(定义为基因表达的时间导数)，可以解释RNA的生物发生和降解。以前的方法无法判断高转录数是由于高转录率还是高水平的转录稳定性。Wu说:“我们的方法为你提供了额外的信息，这样你就可以判断RNA的丰度是由于单独的高转录率还是单独的高稳定性，还是两者的结合。”
Sci-fate继续使用一种算法方法来计算RNA降解。曹说:“我认为这是一个非常有趣的方向。”
研究应用包括测量神经元活动和跟踪细胞状态转变。Wu说，在干细胞和类器官细胞中，后者的应用将是有用的。
曹补充说，研究人员可以使用这些方法来研究药物或环境如何改变不同细胞类型的基因合成和降解速率。“我们对此了解非常有限，”他说。这两种方法都采用了独特的分子标识符(UMIs)来跟踪转录本。利用sci-fate技术，可以在治疗前添加条形码，以追踪细胞暴露于哪种药物。
在他在洛克菲勒新建立的实验室里，曹将研究细胞状态轨迹，以及改进方法的方法。最终，他希望能够标记细胞在活的有机体内但要做到这一点，就需要提高化学转化效率和优化组合标度。
Wu指出，4sU的掺入不是完全有效的，因此是一个需要改进的领域。生物信息学家，如他的合作者邱晓杰，现在在怀特黑德研究所，仍在提出数据分析方法，将代谢RNA标记信息纳入单细胞层面的细胞状态转变分析。Wu指出，scNT-seq还可以与使用6-硫鸟嘌呤的第二次独立化学转换一起工作，这将导致G-to-A转换，从而能够在单个细胞中的两个时间点进行测量。
目前还不清楚各自的技术是否会商业化。曹说，组合索引技术已经获得专利;vwin德赢ac米兰合作Wu说，知识产权格局可能不允许为scNT-seq工作流或底层技术申请专利。vwin德赢ac米兰合作
Wu说:“我们将通过在筛选中识别治疗靶标的生物标志物来探索转化或商业价值。”