一种在组织切片上分析基因表达和蛋白质的新方法提供了高空间分辨率和灵敏度。
这种方法被称为组织测序中的确定性条形码(DBiT-seq)，它使用微流控通道将寡核苷酸条形码作为组织载玻片上的网格坐标，创建所谓的“像素”来帮助后期的空间分析。耶鲁大学容凡实验室的研究人员开发的这种方法，提供了10微米的空间分辨率，可以检测大约15%的通过单分子荧光发现的分子原位杂交(smFISH)。相比之下，单细胞RNA测序通常可以检测到细胞中10%到50%的转录本，这取决于方法。
在一个细胞在上周发表的论文中，研究人员表示，他们可以使用dna结合抗体，从整个转录组中检测22969个不同的基因，以及22个蛋白质。此外，该方法平均每个像素捕获2068个基因。
瑞典生命科学实验室的Joakim Lundeberg教授开发了空间转录组学和高清空间转录组学(HDST)方法，他在一封电子邮件中说:“DBiT-seq为基于ngs的空间转录组学的进化提供了进一步的步骤。”“增加粒度的价值和结合模式的价值从以前单细胞RNA seq世界的工作中是明确的，这里的空间背景为理解组织生态系统增添了额外的风味。总之，这项重要的工作将推动开发更完整的条形码抗体，用于蛋白质组的详细研究原位使用下一代测序作为读出。”
范的团队已经将这种方法扩展到使用甲醛固定的组织切片上，详细内容见BioRxiv预印本发布于8月。范说，他们还将可分析的蛋白质数量增加到500多种。
“我们有兴趣追求DBiT-seq的商业化，使其在广泛的研究界民主化，”范说，但拒绝就细节发表评论。他指出，他的实验室正在向学术实验室免费提供微流控装置的设计文件以及DNA条形码序列。这种方法每个样本的成本约为150美元，其中大部分用于Illumina的Nextera NGS库的准备。
范和其他两位主要作者是与这篇论文相关的一项专利申请的发明人。此外，范主还是康涅狄格州布兰福德公司的联合创始人Isoplexis该公司提供了IsoLight和IsoSpark台式仪器，用于分析细胞蛋白质组、代谢组和分泌体。
DBiT-seq的关键是确定性条形码，而不是随机条形码。范说，他在大约五年前提出了选择条形码在太空中的位置的计划，并在几年前最终组建了一个团队来测试这个想法。
首先，微流控芯片在平行通道上放置一组条形码，这些条形码退火为mrna并启动原位反向转录，生成条形码cdna。这项工作再次以正交的方式进行，在每个车道的交叉点创建包含不同条形码组合的“像素”。待像素在显微镜下成像后，回收cdna，切换模板，PCR扩增，准备进行成对端测序。为了检测蛋白质，首先应用dna -抗体偶联物。
“所有的东西都可以与成像兼容，”范补充说。
DBiT-seq加入了几种基于测序的空间基因表达方法，包括10x Genomics Visium平台，该平台基于瑞典生命科学实验室开发的空间转录组学方法;HDST去年，sciliflab和Broad研究所发布了一种基于条形码珠阵列的方法;而且Slide-Seq这是在布罗德开发的。
范说，DBiT-seq有两个主要优势:10微米的分辨率和每个像素捕获的基因数量——超过2000个。Visium的斑点直径55微米，每个斑点能捕获1000多个基因。与smFISH相比，高清空间转录组声称分辨率为2微米，捕获效率仅为1.3%;在概念证明研究中，研究人员能够识别186个核特异性基因。范说，Slide-seq提供了类似的分辨率，可以精确到大约10微米，但只能捕捉到大约150个基因。
随着新的进展，DBiT-seq也将能够使用更多类型的组织病理学切片，这些切片可以保存多年。
俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health & Science University)教授安德鲁·阿迪(Andrew Adey)说，这种方法似乎也很容易实现。他开发了将单细胞和空间分析更紧密地结合在一起的方法，包括通过指定位置的显微活检进行单细胞组合索引(sciMAP)。他说，芯片是最难获得的材料，但对那些知道如何制造芯片的人来说并不难，而且除了DNA条形码，也很容易获得，其他材料都是现成的。每个样本大约150美元，“与任何商业平台相比，这是一个便宜的价格，”他说。
范的实验室是美国国立卫生研究院人类生物分子图谱项目联盟的一部分，在该联盟下，他的团队将应用这项技术在细胞水平绘制人类心脏组织。vwin德赢ac米兰合作他们还与耶鲁大学的同事合作，将DBiT-seq应用于脑瘤和淋巴瘤组织以及其他肿瘤。
不过，这种新方法并非没有局限性。“它不能准确地选择单个细胞来进行空间测序，2D网格中的一些方形像素可能会覆盖一个细胞、两个细胞或半个细胞，”范说。但是反褶积算法可能有助于分离基因，并将它们分配给幻灯片图像中的细胞，他说，并补充说这与所有其他基于ngs的空间转录组学方法具有相同的局限性。
Adey说，虽然这种方法不是真正的单细胞，但数据捕获了人们期望看到的清晰的区域转录模式，他们与单细胞数据集集成得很好，正如论文中所示。
“增加组合条形码的通道数量将是增加每个组织切片空间多模态测量数量的一个重要方面，”Lundeberg建议。范说，他的实验室正在做的就是这一点，努力一次提供100条条形码，这将给每个样本提供10万像素。
他和他的团队还在设计微流体技术，在一次DBiT-seq实验中，它可以在同一个玻片上绘制4到8个组织切片，并扩展它可以分析的蛋白质面板。
范说:“完全自动化的试剂输送将是一件很棒的事情。”他补充说，手动移管几十个条形码“变得有点烦人”，尽管这对分子生物学家来说并不罕见。