纽约(基因组网)——德国萨尔大学的研究人员发表了一项研究，描述了一种从低输入源测序短rna的新技术——在这种情况下，Mitra家的样本收集设备来自加利福尼亚的Neoteryx。
在一份报告中在分析化学上周，Saarland团队证明，该方法不仅可以有效地分离和读取microrna，还可以有效地分离和读取其他几种小RNA类型。他们还表明，他们的NGS结果是可重复的，并且对基于微阵列的检测相当敏感。
该研究的合著者Andreas Keller是该大学临床生物信息学的主席，他致力于开发研究小非编码RNA分子的技术和方法，其中包括广泛研究的microRNA。vwin德赢ac米兰合作作为这项工作的一部分，他和他的同事此前已经发表的比较不同的测序和基于阵列的小RNA分析方法。
“我们希望对人类小的非编码rna有一个全面的了解，”凯勒在描述该团队的工作时说。这包括哪些细胞和哪些疾病涉及mirna的活性，以及特定分子如何调节这些细胞中的基因和通路。
随着该小组在这些主题上的研究进展，研究人员已经创建了各种基于网络的软件工具(miRCarta, miRMaster, miEAA和miRNA组织图谱)，以帮助其他研究人员使用或建立他们自己的结果。凯勒两年前还在海德堡成立了一家公司，叫做蜂鸟诊断公司该公司专注于开发基于血液的生物标志物，用于早期癌症检测、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等。
凯勒强调，该团队的最新研究只是早期研究，不应被视为该公司任何既定的商业计划。也就是说，蜂鸟确实参与了这项研究，从家用采样设备中提取RNA。此外，凯勒说，该公司正在探索家庭抽样，作为其开发各种筛查、疾病预防和监测策略的一部分。
Keller说，除了展示未来的临床潜力外，这项工作的主要目标是确定他们是否可以从这种远程采样设备中获得RNA测序读数，从而很好地对应正常血液样本。
由于输入材料的限制，mitra分离RNA的分析以前主要局限于微阵列研究。但对这些样本进行测序有几个好处。因为它不需要先天的如果能像微阵列那样了解特定的序列目标，测序就可以对同分异体进行离散的区分——同分异体是相对于参考miRNA序列而变化的序列。它还提供了不仅分析mirna，而且分析小RNA总数的机会。
使NGS在这些有限的干燥样品中成为可能的关键，是使用一种称为模板切换的方法进行无结扎文库制备的应用，该方法结合了3 '端聚(a)尾和随后的基于模板切换的cDNA生成。
“小rna的NGS分析的文库制备程序主要建立在……程序[依赖于]连接适配器，导致5'-单磷酸sRNAs和单个核苷酸的生化偏差。此外，它们在输入材料方面受到严重限制，”该团队写道。
据作者之一、萨尔大学教授马丁·西蒙(Martin Simon)说，这种方法既更敏感，也更少对单个RNA物种的偏见。
在这项研究中，Simon、Keller和同事从四个同意的个体中获得了Mitra墨盒样本，并使用改进的方法从干燥保存的样本中分离出RNA来富集sRNA。
使用500 picgram的Mitra RNA分离株，该团队使用描述的无结扎模板切换方法进行文库制备，然后进行PCR扩增。
研究小组写道:“在对多聚腺苷酸进行测序和修饰后，读取长度分布[显示]大多数读取长度大于37[核苷酸]，这表明文库中有丰富的更长的RNA片段。”他们补充说:“70%的人类基因组组装图谱的绘制效率也表明了一个良好的文库质量和采样中没有大的污染。”
作者报告说，他们产生的最大比例的reads对应于注释的mirna，但他们也能够检测到piwi相互作用RNA (piRNAs)以及小核仁RNA (snoRNA)、小核RNA (snRNA、转移RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)和长基因间非编码(lincRNA)。
该方法似乎没有提供一种全面检测全范围异构体的方法，但研究小组报告说，在文库制备后使用大小选择来限制miRNA部分，可以改善对这些可变序列的解剖。
Simon写道:“我认为NGS相对于微阵列的最大优势在于，我们不局限于mirna，而是可以分析包括pirna、lncrna和trna片段在内的整个小RNA世界。”他补充说，虽然现在还不知道这个更大范围的短RNA和异构体中的其他成员是否可以用作生物标志物，但“他们的分析为未来的替代诊断提供了巨大的可能性。”
最后，研究小组用测序和微阵列并行评估了相同的RNA样本，并比较了这两种分析。数据表明，NGS方法可以比阵列多检测大约20%的mirna。
然而，两种方法检测到的前10个miRNAs不同，两种方法之间只有4个miRNAs (miR486-5p, miR451-5p, let7b-5p, let7a-5p)共享。
“微阵列和NGS各有优缺点。在微阵列上，你有一组可以测量的mirna，而在NGS中，理论上你可以对所有小的非编码rna的全部序列进行排序。你也可以在NGS和所谓的异构体中检测到单核苷酸变体，”Keller解释道。
凯勒和他的同事在其他研究中发现了什么比较NGS和阵列，本研究中更深入的比较表明，阵列结果在样品之间更加稳定。但有趣的是，根据测序结果，四个人类样本中的一个似乎含有与其他样本有本质不同的小rna，尽管这在微阵列数据中并不明显。
凯勒说，该小组希望使用一种可能展示临床潜力的特定疾病模型进一步验证这种方法，尽管他没有具体说明这种疾病是什么。
他写道:“目前，这项研究(是一项更基本的努力)表明，我们有能力从患者携带的家庭采样设备中测序，这些设备可以邮寄到实验室。”
他补充说:“这些应用是否确实具有临床相关性还有待探索。”但是，“这种测试可能适用于需要诊断但专业医生覆盖率不高的农村地区，或者直接面向消费者的测试。”对于专注于已知标记的miRNA检测，NGS很可能比PCR更不适用。
但Simon补充说，由于分离具有良好完整性的RNA比DNA更难，未来使用测序来发现或验证RNA生物标志物的研究可能也需要这样的技术，这使得进行远程、大型队列采样成为可能。