旧金山(基因组网)-基于之前的工作，太平洋生物科学和东北大学的研究人员已经证明，将纳米孔与PacBio的测序系统相结合，可以帮助优先加载长DNA分子，并实现较低数量的输入DNA。
这项研究今天发表在自然纳米技术vwin德赢ac米兰合作，是由一项为期三年的研究支持的结果825000美元的赠款来自国家人类基因组研究所。2014年，该组织发布了第一次结果结果表明，混合纳米孔/零模波导(ZMW)结构可以构建，DNA可以通过该结构加载到测序系统中。
现在，该团队已经证明，这些设备是活跃的，DNA可以测序和读取，重要的是，输入DNA所需的比PacBio测序通常需要的更少。
“这仍然是一个概念的证明，”东北大学的物理学副教授、该研究的资深作者梅尼·瓦努努(Meni Wanunu)说。他说，下一步是进行规模化论证，即为每个ZMW构建包含一个孔的晶圆，而不是单独制造每个孔。此外，他说他的团队计划专注于开发直接RNA测序应用。
PacBio的首席科学官Jonas Korlach拒绝讨论该公司是否计划将纳米孔ZMWs (NZMWs)纳入其商业平台。他说自然纳米技术vwin德赢ac米兰合作该研究“并不以任何方式反映当前或未来SMRT测序平台的商业实施或功能的任何预测。”
瓦努努说，与PacBio合作的目标是找到一种方法，减少系统所需的输入DNA数量，并优先加载较长的DNA分子。
他说，SMRT测序的一个挑战是将较长的DNA分子加载到ZMW中，ZMW是一个100纳米大小的井。目前，DNA模板必须通过生物素-链霉亲和素的化学作用与ZMW结合，分子通过扩散到达ZMW，这一过程更有利于短片段而不是长片段。PacBio多年来改进了这一过程，但输入DNA的要求仍高于纳克水平。
瓦努努的团队提出了一种使用nzmw的方法——本质上是每个ZMW底部的纳米孔——并施加电压驱动DNA通过孔。瓦努努说，这样的构象使得输入DNA的数量能够像picogram一样多，并且优先加载较长的DNA片段。
如前所述，研究人员在硅氧化膜上建立了波导，其纳米孔直径为3到5纳米，在波导的底部使用透射电子显微镜制作。
然后，该团队使用了6个NZMWs阵列，研究了DNA片段是如何被捕获到NZMWs中的，其片段大小从1千碱基到48.5千碱基不等。
该团队演示了一个10皮克的DNA样本可以在不到一分钟的时间内加载。作者写道，相比之下，传统的10千碱基SMRTbell样品磁珠加载需要1.5纳米克输入DNA，耗时1小时。
接下来，该团队演示了他们可以捕获与聚合酶结合的DNA，从而实现测序。在PacBio测序中，DNA模板与DNA聚合酶链霉亲和素融合蛋白结合，然后与波导上的生物素基团结合。该团队证明，他们可以在NZMW的底部创建一个类似的DNA聚合酶链霉亲和素复合物来捕获DNA。
然后，他们在一个有大约100个ZMW的膜上创建了一个2乘2的NZMW阵列，以比较NZMW与标准ZMW的测序。他们首先测试了一个72个碱基的环状DNA和DNA聚合酶模板。加入模板DNA和荧光标记核苷酸。
然后，研究人员施加了3个1秒长的电压脉冲，捕获并固定了NZMWs上的DNA。然后聚合酶被激活，测序开始，从核苷酸被合并的荧光爆发可以看出。荧光爆发只出现在NZMWs中，而没有出现在ZMWs中，因为在短短3秒的加载时间内，没有模板DNA加载到标准ZMWs中。但四种nzmw都在那段时间捕获了DNA。
最后，研究人员演示了一个已知的20千碱基SMRTbell测序结构。他们使用了不到一纳克的输入DNA，并施加了两秒的电压脉冲将DNA加载到NZMW上。
因为研究人员没有使用PacBio的实际仪器，瓦努努说，该团队必须设计自己的生物信息学来进行基地呼叫。该算法的单次读取准确率为67%，读取长度约为1.6千基。
瓦努努预计，如果使用实际的商用仪器，其性能会更好，而不是东北大学团队的实验设计。“我们正在使用的系统是基于PacBio的设计原则复制的，”他说。“我们的衬底有一些固有的噪声，比PacBio的高。”
他说，下一步将是继续优化设计，包括扩大NZMW的设计，以便每个NZMW不必单独制造。他说，该团队目前正在研究一种使用“多孔基板”的方法，而不是在基板上钻孔。
此外，瓦努努的团队还与PacBio合作开发直接RNA测序技术。去年,NHGRI授予他的实验室斥资170万美元，开发了一种用于picgram输入水平的直接RNA和DNA测序的NZMW版本。
Wanunu说，他计划利用实验室开发的NZMW装置专注于直接RNA测序。“一旦我们能够证明DNA和RNA的高质量测序，然后我们就可以考虑与PacBio的仪器整合”。“我们还有很长的路要走，”他说。