纽约(基因组网)-哥伦比亚大学领导的团队开发了一种低覆盖率的RNA测序技术，用于检测经过筛选分析的细胞中的调控网络变化和表达变化。
这种被称为“转录组表达的池化文库扩增”(PLATE-seq)的方法包括在文库制备方案的早期阶段对样本进行条形码编码，以便许多样本可以被池化。然后，研究人员对汇总的条形码样本进行浅测序，重点关注基因的3'端，然后通过计算解开每个原始样本中的广泛表达模式和调控基因活性变化。
在本金证明中研究发表在自然通讯本周，来自哥伦比亚大学医学中心和达尔文健康的研究人员证明了这种方法在人类细胞系中的可行性，将其与TruSeq RNA测序和基于表达阵列的连接映射方法进行了比较。
该研究的共同资深作者、哥伦比亚大学系统生物学研究生研究主任彼得·西姆斯(Peter Sims)解释说，PLATE-seq“有一个便宜得多的文库构建协议，但也涉及到对所得到的文库进行测序，其深度比常规RNA测序低得多。”
西姆斯说:“这两件事加在一起使成本比传统的RNA-seq低10倍多一点。”他指出，当考虑到每次实验的样本数量时，PLATE-Seq的价格也比基因表达阵列低。
他解释说:“我们正在利用新一代测序的多路复用机会——将数百个样本混合在一个流式细胞中。”“我认为这是一个主要优势。”
一般方法可用于测量样品的表达，用于一系列药理学分析、功能分析、灵敏度筛选等。例如，Sims和他的同事们特别热衷于将PLATE-Seq与药物筛选分析相结合，作为一种估计伴随给定药物反应的基因表达、调节变化和蛋白质活性变化的手段。
Sims解释说:“我们开发PLATE-Seq的原因是我们真的希望能够在药物筛选的背景下进行RNA测序分析。”“这些筛选通常有非常多的实验条件，所以典型的RNA测序太昂贵了，不适用于这种情况。”
为了在plate - seq中并行评估尽可能多的样本，研究人员建立了一种方案，包括直接在用于进行高通量筛选的同一板上裂解细胞。从那里，他们将样本转移到一个低聚(dT)板上，该板捕获信使rna，然后将它们移到第三个板上，在反转录步骤中引入样本特异性条形码。
一旦条形码，样品继续通过库准备协议。在测序步骤中，该团队通常为每个样本生成50万到200万份原始读数。
尽管该方法理论上与任何下一代测序平台兼容，但研究人员目前已将其与Illumina短读测序配对，特别是因为PLATE-Seq主要关注每个信使RNA的3'端。
“我们的文库可能包含非常长的，也许是全长的cdna。因此，像PacBio或纳米孔测序这样的东西有可能从PLATE-Seq文库中获得比Illumina测序仪更多的信息。”“但我们的重点是本质上最大限度地提高每美元可以处理的样品数量，所以对于我们的特定应用领域——主要是扰动屏幕——你希望它尽可能便宜。”
在计算方面，该团队利用了毒蛇算法共同资深作者和哥伦比亚大学研究员安德烈·卡利法诺发展到从大型数据集中理清监管网络，包括转录因子与其靶标之间的相互作用。
西姆斯解释说，基于这些网络中的信息，研究人员推断，他们可以开发一种实验协议，以产生廉价的、低深度的RNA测序数据，这些数据可以与VIPER配对，以梳理出基于更广泛网络知识的基因表达和调控变化。
“(VIPER)与PLATE-Seq非常相配，”他说。“因为如果你知道某个特定监管机构的目标，你就不需要检测该监管机构来推断其活性:如果你可以用像PLATE-Seq这样的低覆盖率方法检测到其目标的一个子集，你就可以推断出该监管机构的差异活性。”
用于解释VIPER数据的调控网络可以通过计算推断，也可以通过对几种已知调控分子的染色质免疫沉淀测序和/或一系列其他可能的实验生成的调控数据来解释。
例如，在他们的新研究中，西姆斯、卡利法诺和同事们将PLATE-Seq应用于BT20人类细胞，这些细胞暴露于7种小分子治疗，包括化疗药物克唑替尼和吉西他滨。他们报告说，在那里，PLATE-Seq发现了大约四分之三用更昂贵、更耗时的TruSeq RNA测序方法鉴定的转录本。
这种比较表明，每种RNA测序方法都导致了可比的基因表达签名和viper预测的蛋白质活性谱，而该团队在另一种人类细胞系中的实验表明，PLATE-Seq在细胞筛选设置中也优于基于阵列的表达谱。
尽管如此，Sims警告说，该策略不太适合更精细的表达分析，例如评估转录本剪接分析或特定基因异构体的表达。
研究人员正在继续改进该方法，以期提高灵敏度和可扩展性。他们已经将该方法应用于几个筛管，每个筛管大约需要8到16个96孔板，并且正在进行可以处理384孔板的PLATE-Seq实验。
西姆斯说:“一旦我们能正常工作，每次运行的样本数量可能会增加很多。”“我们大多数药物研究都是以这种形式进行的，所以这会让事情变得更简单。”
预计PLATE-Seq方法将应用于各种各样的研究应用——从药物筛选到更基础的生物学研究。西姆斯指出，他们已经尝试将其用于组织异质性研究，也用它来比较在同一组织标本的不同部分进行的多个核心活检中的表达，“以相当便宜的价格获得组织在表达空间中的空间图。”
“我们在每个样本中检测到超过1万个基因，”他说，“这是很多信息。”
哥伦比亚大学基因组中心的高通量筛选设备目前为其他研究人员提供PLATE-Seq与筛选相结合的服务。由卡利法诺共同创立的DarwinHealth公司目前与哥伦比亚大学签订了PLATE-Seq服务合同，为该公司基于rna的精准医疗方法生成数据。
在一封电子邮件中，Califano指出，该公司正在建立药物扰动数据库，例如使用PLATE-Seq将患者与特定的治疗药物进行匹配。达尔文健康首席科学官马里亚诺·阿尔瓦雷斯与人合著了本周的报告自然通讯西姆斯和卡利法诺的论文。