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巴尔的摩——来自悉尼Garvan医学研究所的研究人员和他们的合作者利用可编程的靶向长读纳米孔测序，设计了一种测试，可以检测目前已知的所有与罕见神经疾病相关的短串联重复序列(STR)扩展，这表明了一种潜在的途径，可以结束这些疾病患者的诊断漫长之路。
在上周发表的一项概念验证研究中描述了该实验科学的进步，利用牛津纳米孔技术公司的长读取测序工作流及其最近发布的选择性测序软件功能。它能够识别所有已知的神经致病性STRs，涉及超过50种神经和神经肌肉疾病，跨越数十个基因，同时提供DNA甲基化谱，从而能够诊断具有挑战性的遗传疾病。
“我们选择关注这些短串联重复障碍有几个原因，”加文研究所基因组技术负责人、该研究的资深作者Ira Deveson说。他说，其中之一是STR的扩大，占人类基因组的7%左右，可以导致大量的遗传性疾病，包括亨廷顿氏病、脆性X综合症和遗传性小脑共济失调。
他补充说，另一个原因是，尽管STR扩张性疾病种类繁多，总体发病率很高，但临床上仍然很难诊断。Deveson说，目前有一些“老派分子生物学技术”，如Southern blot和重复引物PCR，可以帮助识别特定疾病表型的STRs。然而，这些方法通常一次只能针对一个基因。他说，因为许多STR扩张障碍的症状重叠，“你可能会陷入这样一种情况:患者不得不进行漫长的诊断，进行多种不同的测试。”
Deveson指出，尽管下一代测序有希望检测到STR扩增，但STRs的大尺寸和高度重复性使其难以用短读测序方法解决，如Illumina测序，尽管英国的研究人员最近使用了全基因组Illumina测序和新型检测软件各种重复扩张障碍。
他解释说，重复序列通常有数千个碱基长，而短读测序则试图将数百个碱基的片段拼接在一起。“这有点像尝试做拼图，所有的碎片看起来都一样。”
为了解决这个问题，Deveson的团队在测试中使用了牛津纳米孔测序。ONT测序“真正令人兴奋”的一个方面是它“没有读取长度的上限”，他说。“T帽可以让你直接按顺序完成这些长而重复的序列，直接阅读或解决它们，而不需要任何戏剧性的挑战。”
在他们的研究中，研究人员分析了37名参与者的基因组DNA样本，包括25名患有各种神经遗传疾病的患者和12名没有疾病的对照组。Deveson说，分析这些具有“相当明显的神经障碍”并“接受过标准分子检测范式”的患者的目标是展示该检测在诊断STR扩张性疾病方面与传统检测一样成功的能力。
重要的是，该试验采用了牛津纳米孔的技术ReadUntil软件，一个最近发布的自适应采样功能，允许平台针对特定的DNA片段。Deveson解释说，ReadUntil可以“非常迅速地识别进入小孔的DNA片段”，如果它看起来不感兴趣，它可以“停止对小孔的测序，并将该片段吐出来”，使测序“更加高效和有效”。此外，与其他基于湿式实验室的富集方法相比，如使用Cas9, ReadUntil不需要任何额外的实验室程序。Deveson说:“这种设备本身实际上是在程序化的方式进行所有的靶向基因选择，这真的非常令人惊讶。”
作者指示ReadUntil靶向共37个已知的与神经和神经肌肉疾病相关的STRs基因。利用测序数据中STR位点的单倍型解析组装和DNA甲基化分析，该方法成功地识别了所有患有STR扩张性疾病的个体，包括亨廷顿舞蹈病;脆性X综合征;小脑性共济失调、神经病变和前庭反射综合征(CANVAS);spinal-bulbar肌肉萎缩;肌强直性营养不良1型;神经元核内透明包体病;弗里德希氏共济失调;肌萎缩性脊髓侧索硬化症;脊髓小脑性共济失调1型; and oculopharyngeal muscular dystrophy.
Deveson说，结果表明，该测试“至少一样好”，实际上“似乎比现有的分子方法要好得多”。他指出，该测试甚至能够在一些致病基因中提取STR等位基因，如RFC1。这与CANVAS有关——传统的分子方法或短读测序无法解决这些问题。
此外，通过ReadUntil，该团队能够在MinIon测序仪上实现与在PromethIon (ONT最高吞吐量平台)上进行全基因组测序类似的目标基因覆盖。Deveson说，该研究报告了使用ReadUntil大约5倍的测序富集，“这有效地使你的检测每数据单位便宜5倍。”此外，由于ReadUntil是可编程的，该团队能够添加28个药物基因组基因作为第二靶点，以帮助预测患者的药物反应和治疗预后，证明了该检测方法的灵活性和多管共下的靶向检测的兼容性。
“我真的很喜欢这篇论文，”西雅图儿童医院(Seattle Children’s Hospital)儿科和遗传学联合项目的住院医生丹尼·米勒(Danny Miller)说。他说，因为这种检测一次就能提供“大量信息”，“它显示了在研究环境中以及有望很快在临床环境中使用的效用。”
医生科学家米勒和他的团队也是使用牛津纳米孔测序解决人类基因组中难以诊断的致病性变异，有时借助ReadUntil功能。他认为，这项研究代表了证明长读测序在STR扩展障碍测试中的效用的“一个非常好的第一步”，尽管“许多未解决的问题”仍有待解决。
首先，Miller说他“仍然不相信”ReadUntil功能会比临床实验室的全基因组测序更有效。尽管他承认使用ReadUntil在理论上有成本优势，但他表示，该功能仍更可能需要“额外的动手时间”，因为它“不是每次都能完美工作”，影响了它的竞争优势。
Miller说，另一个潜在的问题是单个序列读取之间的扩展的可变性。他解释说，在他自己的研究中，他的团队已经看到了重复拷贝数在相同目标重复扩展的不同测序读取之间的可变性。如果发生这种情况，“你要怎么报道?你需要阅读多少次才能报道你信任的东西?”“我认为我们还不知道。”他说，要在临床实验室采用这种测试，每个实验室都需要“拿出自己的指南来确定，‘我们需要看到什么，才能称之为成功的实验，我们才会批准。’”
此外，Miller说，鉴于均聚物和内嵌物是“纳米孔(测序)的最大误差来源”，人们需要“在使用纳米孔(测序)观察重复扩增或基因组中的任何重复单元时非常小心”，并“进行某种类型的系统评估”来验证测试的准确性。
堪萨斯城儿童慈善医院基因组医学中心主任Tomi Pastinen也表示，这项研究有很多优势。他说:“以前的研究只关注个体重复，而不是许多不同的重复。”“这项研究使用了来自已知疾病病例的多个阳性对照，在检测重复基因方面显示出良好的敏感性和特异性。”Pastinen集团还在研究长阅读以解决棘手的遗传疾病病例。然而，他的团队主要使用太平洋生物科学公司的HiFi测序，而不是使用纳米孔测序。
尽管长读测序在分析STR扩张方面具有优势，但与软件相结合的短读测序在检测神经重复扩张障碍方面也表现出优于传统检测方法的能力。例如，最近发表在《柳叶刀神经病学Illumina和英国研究人员的研究表明，在Illumina开发的基于序列图的工具ExpansionHunter的帮助下，全基因组测序在检测13个最常见的重复扩增位点的重复扩增时，与传统PCR检测相比，具有97.3%的灵敏度和99.6%的特异性。
Pastinen说，在用短读测序检测重复扩张方面，ExpansionHunter“正变得越来越好”。“但据我所知，这不是迄今为止广泛使用的诊断方法。”
他指出，新的纳米孔测试的一个弱点是，“它仍然处于与个体重复障碍测试相同的心态”，因为它是“一个靶向测试”，因此成为“一个独立的测试，[临床医生]将与基因组测序并行。”
他说，该测试的另一个局限性是“对已知的重复性扩张疾病的限制”。由于该测试要求研究人员编写ReadUntil程序以寻找特定的致病基因靶点，因此检测仅限于先前已定义和研究过的现有扩张性疾病。
与Miller类似，Pastinen也表示，尽管ReadUntil功能是“一个非常好的功能”，但他不确定它能否在标准的临床实验室环境中使用，因为对患者和提供者来说，测试的简单性和恢复时间是“更重要的事情”。
Deveson说，目前该测试的周转时间约为75小时，用于图书馆准备和测序，加上约24小时的生物信息学分析。因此，他认为一周的周转时间绝对是“舒适的”。
他还承认，ReadUntil方法不适合基因发现项目，高通量全基因组纳米孔测序“将是前进的道路”。
展望未来，Deveson说他的团队有兴趣为该测试寻求临床认证。为了实现这一目标，下一步将是“分析一个更大的深度特征参考样本队列”。尽管他乐观地认为，该测试将经历类似于短读测序的临床验证过程，但他说，他可以预见的一个障碍是纳米孔测序“技术发展非常迅速”，因为它是一项相当新的技术。vwin德赢ac米兰合作“纳米孔装置、化学测序和软件的更新一直在进行，”他说。“但从临床验证和认证的角度来看，你需要锁定所有这些东西，坚持使用当前版本——你不能每隔几个月就更换一次。”
他补充说，未来的研究可能会招募目前研究中没有包括的STR扩张障碍患者，“因为我们只是想确保覆盖尽可能广泛的范围。”最终，他希望将该方法应用于开发类似的测试，不仅用于神经系统重复紊乱，还用于“任何其他有挑战性突变的基因紊乱”。
至于这项测试的潜在商业化，Deveson说他和合作者“并不认为这是一项商业冒险”，也不认为从知识产权的角度来看有什么值得关注的。相反，他说，“我们主要感兴趣的是制作一种新的有效的测试，它将改善对这些复杂疾病患者的诊断。”