巴尔的摩-意大利的研究人员已经证明了长读纳米孔测序在实时检测遗传疾病患者的拷贝数变异(CNVs)方面的有效性。
由佛罗伦萨大学的Alberto Magi领导的研究小组将纳米孔测序应用于7名已知致病性CNVs患者的队列，并将该方法与传统分子核型分析技术的性能进行了比较。
研究结果发表在分子诊断学杂志上个月的一项研究表明，纳米孔测序有潜力实现各种大大小小的CNVs的快速、实时检测，同时提供对传统细胞遗传学方法无法轻易识别的镶嵌事件的洞察。
“识别和检测拷贝数变异对医学非常重要，”马吉说，他是佛罗伦萨大学生物工程教授，也是这项研究的首席研究员。玛吉说，CNVs是人类基因突变的重要组成部分，与大量疾病有关，包括心血管疾病、神经发育障碍和癌症。
他说，目前，传统的细胞遗传学技术和染色体微阵列分析仍然是检测大型和小型CNVs的主要工具。此外，他补充说，下一代测序也能够识别CNVs，尽管由于成本高，该方法并不普遍。
然而，Magi说，所有这些方法都受到费力的实验协议和相对较慢的周转时间的限制，诊断时间延迟了3到15天。虽然传统的细胞遗传学仅限于检测大型CNVs，但微阵列和基于nggs的检测方法可以检测较小的CNVs，但这些方法的低特异性使它们无法识别CNVs中的嵌合性，即含有变异的细胞部分。
此外，Magi说，用现有的分子和基于测序的方法，人们必须等到实验结束才能得到结果。相比之下，纳米孔测序为研究人员提供了实时检测CNVs的机会，有望“大幅”减少检测的周转时间。
在发表的研究中，研究人员从7名患者中提取了基因组DNA，这些患者之前已经确诊了不同大小和不同水平的嵌合体CNVs。他们制备了纳米孔测序文库，并使用R9.4.1流式细胞在Oxford nanopore Technologies的GridIon设备上进行了长达48小时的测序。据Magi介绍，从DNA提取到加载流池的湿实验室工作流程大约需要两个小时，样品进行了浅层测序，覆盖范围大多为5到6倍。
为了实现数据的实时分析，研究人员部署了一款名为Nano-Gladiator的软件，这是Magi团队之前开发的一款软件，用于检测从运行开始后30分钟到48小时内的多个时间点的测序读数中的拷贝数变化。他们还比较了纳米孔测序的样品到结果的时间与最先进的基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)方法的时间。
根据这项研究，结果表明，只需在测序运行30分钟后，纳米孔数据就可以挑出较大的染色体异常，而使用传统的核型分析方法，从样本处理到数据分析通常需要几天时间。
Magi说，随着测序的进行，分析的分辨率继续提高。具体来说，数据表明，在产生50万到100万次读取后，在测序6到9小时内可以检测到约1 Mb的微删除和微重复。
然而，Magi说，该团队在24小时后观察到一个数据平台期，那时将近90%的测序读取已经生成。尽管如此，在测序30小时后仍然可以观察到小于500 kb的小CNVs，因此从样本到诊断的周转时间约为两天。研究人员指出，这比aCGH短，aCGH至少需要三天才能确诊。
重要的是，Magi说，使用aCGH，由于它的分辨率，研究镶嵌现象“几乎不可能”，而纳米孔测序能够通过识别发生改变的细胞的确切百分比来准确地描绘镶嵌事件，他认为这是“非常革命性的”优势。
Magi指出，该研究还发现了“极少数”假阳性事件，这些事件被归类为从纳米孔测序中获得的cnv，与aCGH结果没有重叠。Magi说，假阳性率随着测序时间的增加而增加，主要是在6小时后，并且与用于分析检测的窗口大小相关。他指出，在测序运行的开始，当检测到大量的cnv时，没有出现假阳性。
Magi警告说，因为结果是与aCGH相比的，aCGH的“分辨率有限”，不能检测出所有的cnv，所以很难说在这项研究中发现的假阳性事件是否真的是假阳性。
“我认为这是一篇可靠的论文，”约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)生物医学工程教授温斯顿·蒂姆普(Winston Timp)说。他补充说，在实际的临床应用方面，研究人员“真的在尝试挑战纳米孔测序的极限”。
Timp说，与传统的细胞遗传学技术相比，基于测序的方法除了能够识别CNVs外，还能够揭示更多层次的遗传信息。他说:“由于有了序列信息，你可以得到更多关于(CNV)在哪里、发生了什么以及CNV是如何构成的详细信息。”他还补充说，这项技术也有可能成为“一站式服务”，提供“关于患者基因组状态的几个不同方面的非常深入的详细信息。”vwin德赢ac米兰合作
虽然该研究是该领域更广泛运动的一部分，以牛津纳米孔为代表的便携式、低资本投资测序设备的应用，以解决临床问题，Timp强调，认识到成本也很重要。
“除了速度、实际操作时间和劳动力，我们还需要考虑成本问题，”他说。“我认为，该领域正朝着更多地使用测序来进行诊断的方向发展，但我认为我们真的需要记住保持这些东西负担得起的问题。”
Magi呼应Timp的观点说，目前在临床中使用纳米孔测序进行CNV检测的一个限制是成本。他说，一个aCGH实验的平均成本约为100美元，而一个纳米孔的消耗品成本约为500美元。Magi说:“有一个差距需要缩小。”他补充说，该团队未来的方向之一是继续降低测试成本。
除此之外，马吉说，他的团队计划在今年年底前在至少100名患者的更大队列中测试该方法，尽管他说“很难找到具有预定义拷贝数变体的特征良好的样本”。
此外，Magi说他的团队也在考虑扩大检测的覆盖面。目前，通过浅测序，该方法可以检测到重复和删除。然而，Magi说他的实验室希望在今年秋天收到PromethIon 2 Solo——牛津纳米孔公司高通量测序仪的更新版本，并计划将全基因组测序深度增加到至少30倍。
他说:“在这个覆盖范围内，我们不仅可以识别拷贝数变异，还可以识别整个结构变异、倒置、删除、重复、插入和易位的光谱。”