纽约-研究人员发现DNA N6-methyladenine马(6)植物和动物的样本可能需要再仔细观察一下。高水平的修饰在很大程度上可能是由于污染，要么来自有机体微生物组中的细菌，要么来自分子生物学中常用工具引入的质粒。
这是西奈山伊坎医学院(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)的研究人员方刚(Gang Fang)传递的信息，他的团队本月早些时候发布了使用6mAScope的数据，6mAScope是一种新的基于长读测序的策略，可以在几种类型的样本中识别6mA的来源，包括单细胞真核生物，果蝇，拟南芥以及人类细胞系和组织。
他说:“我们只能谈论我们检测过的样品。”虽然研究发现，绿藻和原生生物中的6mA水平与这些生物的基因组有关，但在昆虫和植物中，90%以上检测到的6mA与可能的污染源有关。他说:“但我们想提醒人们更多地关注或可能重新审视一些早期的报告，特别是关于多细胞真核生物的报告。”
这篇论文，发表于科学这是一系列论文中的最新一篇，这些论文对早前关于多细胞生物体内6mA水平升高和分化的报道提出了质疑。
“我们用来检测6mA的一些技术容易出错，”波士顿儿童医院和哈佛医学院的表观遗传学研究人员埃里克·格里尔(Eric Greer)说角度块在科学相关方的论文。大多数关于这一主题的研究使用高效液相色谱与质谱联用或长读测序——特别是来自太平洋生物科学公司的研究。“这两种技术都存在研究人员没有意识到的固有问题，”他说。为了解决这些问题，一些小组调整了他们的方法，“得到了6mA的更精确的量化数据，”他说。
但许多研究人员支持这样一种观点，即后生动物基因组可能存在显著水平的定向6mA修饰。耶鲁大学(Yale University)的研究员安德鲁·肖(Andrew Xiao)说，这项研究“做得很仔细，但有几件事需要澄清”，他自己也认为6mA的水平高于这篇新论文提出的水平。“提纯哺乳动物DNA和细胞类型的微妙之处可能会导致不同的结论。”
该研究没有在人体样本中发现高水平的细菌污染。基于pacbio的方法的局限性意味着它可能无法识别具有次级DNA结构的基因组区域中的6mA，而次级DNA结构被认为是哺乳动物基因组中许多这样的修饰的港湾。
两大阵营至少在一件事上达成了一致:只有具有单碱基分辨率的新测序方法才有可能解决这场争论，尤其是在人类身上。幸运的是，这些方法，即类似于甲基化亚硫酸氢盐测序方法的化学转换，已经实现了。
争论的开始可以追溯到2015年左右，当时格里尔的团队报告发现了6mA秀丽隐杆线虫基因组，和陈大华的中国科学院动物研究所的报告果蝇．多个实验室纷纷效仿，大量论文发布了动植物体内6mA水平的惊人结果。质谱和长读测序方法已经表明，6mA——已经被确定为在细菌中大量存在并对基因组调控有影响——可能存在于百万分之数百或更多的水平模型系统而且人类细胞．
虽然比重要标记如5-甲基胞嘧啶出现的频率要低得多4%6mA是人类基因组中所有胞嘧啶的重要组成部分，并被用于多种液体活检检测方法中。这些研究让人们看到了希望，6mA可能是人类发育和疾病的重要生物标志物。
肖说，他对人类胶质瘤干细胞中6mA含量的最佳猜测是在10到100ppm之间。”年代有时更高，”他说。“在某些疾病中，我们看到它上升了，有时是10倍。”
但在2017年，一个德国研究团队报告中没有发现小鼠细胞和组织中存在6mA的证据。包括格里尔在内的研究人员开始寻找实验误差的来源和量化方法。格里尔说，质谱仪虽然分析精确，但无法区分感兴趣基因组中的6mA和污染细菌基因组。2019年，他的实验室发表了一项研究识别来自微生物的污染，以及用于消化和纯化样品的酶，样品通常是从细菌中纯化出来的。
基于他的论文，Greer说他对人类细胞中6mA的“真实”水平的最佳猜测是1或2 ppm。格里尔说，方的基于测序的新方法提供了类似的估计。
在质谱仪的同时，研究人员还使用基于测序的方法来检测6mA。一些方法使用抗体6mA拉下序列，而另一些方法使用PacBio检测表观遗传修饰的能力基于其测序化学中聚合酶结合碱基的差异。(牛津纳米孔技术公司的平台已经被证明可以从原始信号中检测6mA，即使是在果蝇；然而，该公司仍在努力正式添加这种能力给它的基站呼叫软件。)
有了使用PacBio检测细菌中6mA的经验，方相信他的实验室有能力复制最初的高水平结果。他们立即成功地在绿藻中找到了6mA。“但当我们研究其他生物时，我们有了一些疑问，”他说。
PacBio的方法，在细菌基因组中发现6mA非常有效，但当转向植物和动物基因组时，导致了某些盲点。为了检测DNA修饰，PacBio依靠其测序化学的一个奇怪之处:表观遗传修饰碱基(以及其他附近碱基)的碱基合并的间断表现为荧光脉冲之间的时间差异，称为脉冲间隔时间(IPD)。PacBio的算法利用IPD中的这些差异来进行表观遗传修饰。
Fang和Greer认为，当6mA充足时，就像在细菌中一样，修改调用算法执行得很好。但简单地将该方法移植到其他6mA更罕见的样本上，可能会导致假阳性。“要找到非常稀有的东西，避免误报是非常具有挑战性的，”方说。
PacBio的平台不能区分6mA和1mA，这是一个DNA损伤标记，Greer说，这可能会引入更多的错误。在最近引入HiFi测序协议之前，PacBio的长读取很容易出错，有phred评分在Q20左右达到峰值，错误率约为1%。最后，也许也是最重要的，这种方法需要与参考基因组进行比较——即感兴趣的基因组。这种比较究竟是如何进行的还不清楚。根据PacBio白皮书， IPD比值可以使用放大控制或计算在网上控制。PacBio拒绝回应一系列关于其改良碱基检测方法的详细问题。
PacBio首席技术长Jonas Korlach在一份声明中说:“虽然我们最初的碱基修饰检测工作流程是测量碱基在比对参考基因组后是否甲基化，但这项工作表明，在比对参考基因组和序列识别之前，可以在单个DNA分子上检测到甲基化，这简化了分析，并打开了许多令人兴奋的机会，如这里所描述的。”“通过检测单个DNA分子上的6mA，而不需要化学转换，利用PacBio高度精确的HiFi序列读取，同时获知它们的分子身份，该研究代表了另一个例子，证明了HiFi测序的力量，为基因组和表观基因组的复杂生物学提供更深入的见解。”
方的团队试图用PacBio的方法解决两个潜在的问题。首先，他们通过使用200- 400 bp的短序列的循环一致测序提高了准确性。其次，这些序列不被认为是感兴趣的原始基因组的一部分;他们还与潜在的污染源进行了比较。使用机器学习算法，该模型将每个序列分配给一个源。只有这样，每个物种的6mA水平才被量化。结果通过质谱仪验证。
对于多细胞生物，结果是明显的。小于2%的6mA果蝇样本可归因于该基因组。相反，6mAScope认为这种改变来自肠道微生物。为拟南芥方说，在美国，超过95%的6mA来自土壤细菌。
他说，考虑到细菌的6mA可能是多细胞生物的1000倍，即使是一点点污染也会对结果产生很大影响。
该研究的人体样本没有被细菌污染，方说。但我们也没有发现高水平的6mA。我们不能说之前的发现是否与污染有关。”在论文中，他的团队提出，人类样本中的一些6mA可以用质粒或大肠杆菌基因组DNA。
肖、格里尔、甚至方舟子都清楚，这篇新论文有几个局限性。方强调，他的研究结果只适用于他为论文分析的特定样本类型。他不会推测其他类型的样本。”因为我们没有获得样本，我们并不意味着之前的研究是错误的，”他说。
肖指出，这项研究分析了胶质母细胞瘤组织，而不是具体的胶质母细胞瘤干细胞。”这是胶质母细胞瘤组织中非常小的一部分。”“如果你研磨整个组织，用质谱仪和测序分析，我不认为它们会非常显著地显现出来。”
他说:“这里没有苹果和苹果之间的比较。”
此外，6mAScope可能有自己的盲点。在细菌中，6mA与双链DNA中的“GATC”基序有关。哺乳动物的6mA似乎没有基序，它发生在大量DNA二级结构的区域，这对SMRT-seq是一个挑战。”
除了可能在二级结构中缺失6mA外，哺乳动物细胞中对6mAScope的控制包括过表达一种细菌甲基转移酶，“它只修改GATC序列，”肖说。哺乳动物基因组中6mAScope的检出限是基于dsDNA构象的基序驱动模型;因此，我们有兴趣看看这个模型是否可以外推到DNA二级结构富集的非基序驱动区域。”
方回应说,细菌6mA事件不仅发生在“GATC”位点。“我认为这是真核表观遗传学领域的普遍误解，”他说。相反，6mA事件是在大量的序列环境中发生的。在我们的论文中，我们证明了6mA在跨越非常丰富的序列上下文的SMRT测序中具有定义良好的签名。”他指出，除了过表达甲基转移酶外，该研究还包括了额外的对照，其中6mA被添加到额外的基数中。
格里尔指出，尽管方的团队研究了线粒体DNA，并没有发现大量6mA的证据，但他们并没有在压力条件下进行研究。在一定的生物条件下，可以诱导这些修饰。
对于6mA丰度较低的样品，它只能提供修饰的总体数量的数据，而不能提供修饰的具体位置(Fang指出，它可以对细菌和单细胞真核生物做到这一点)。
Greer和Xiao都认为，关于6mA的争论将持续下去，直到研究人员能用单碱基分辨率绘制出这些修饰。除了6mA修饰的绝对水平，一个主要问题是它们是否是随机的。
肖说:“我们不知道这些位点在哪里，它们是分散在基因组中，还是集中在关键的调控区域。”“只有类似于亚硫酸氢盐测序的东西才能解决这个问题。这是目前该领域最关键的问题。”
值得庆幸的是，化学转化样品制备方法即将到来。其中最有希望的一个，Nitrite-seq，涉及到类似于亚硫酸氢盐甲基化测序的化学转换。它由加拿大约克大学的研究人员开发，在酸性条件下使用亚硝酸钠将除6mA外的所有腺嘌呤转化为鸟嘌呤。格里尔说，他的实验室已经设想了另一种可能的化学物质，但还没有开发出来。
肖指出，这种转化将使单链和双链DNA的分析成为可能。
格里尔说，化学转化“将帮助我对碱的实际发生地点更有信心”。