由研究人员领导的团队加州大学圣地亚哥分校的一名研究人员发现，对一组患有遗传疾病的患者的外显子序列进行测序，导致近10%的患者的诊断发生变化。分析还确定了近20%患者的可能致病基因，以及约四分之三患者的一小部分候选变异。
的研究，上周出版于科学转化医学他是第一批研究外显子组测序在一组患者中的效用的人之一，而不是提出一个成功病例的结果，即外显子组测序导致了诊断。
由于队列的性质——这项研究只包括患有隐性疾病的近亲家庭，而且只包括那些已知候选基因检测为阴性的家庭——结果不能在一般疾病诊断中推断外显子组测序，但它证明了它对这类患者群体的效用。
作者写道:“这项工作的主要发现是，在识别特定患者之前未怀疑的基因突变方面，全外显子组测序比单个候选基因测序更有益。”
加州大学圣地亚哥分校神经科学和儿科系教授、该研究的资深作者乔·格里森(Joe Gleeson)表示，单是成本原因，就有可能使外显子组测序很快取代候选基因测序，成为一种标准的临床诊断测试。他说:“如果你打算进行基因检测，不妨从外显子组开始。”
格里森的实验室一直在研究儿童发病神经发育疾病的遗传学，包括智力残疾、癫痫、自闭症、结构性脑部疾病和神经肌肉疾病。他说，目前只有一小部分患者接受了基因诊断，这“确实限制了治疗”。“我们开始这项研究的目标是找到新的基因。”
研究人员专注于患有隐性疾病的近亲家庭，因此他们只需要考虑纯合变异，就可以排除外显子组测序识别的大量杂合变异，这是这种方法的一个挑战。
到目前为止，他们已经从中东招募了大约2000个近亲家庭，上周的出版物展示了他们试点项目的结果。
在这个项目中，研究人员从188个家庭开始，每个家庭至少有两个孩子患有神经发育疾病。他们排除了40个家庭，因为他们发现这些家庭的已知致病基因与患者最初的诊断相关。
格里森说，对这些已知基因突变的检测花了两名工作人员大约一年的时间，这是一项巨大而昂贵的工作，在外显子组测序价格下降的情况下，这种工作已经不再合理。他说，在试点研究时，为每个患者测序外显子组的成本约为5000美元，现在已降至1000美元，而候选基因测序的成本保持不变。
因此，格里森的实验室现在已经完全停止了候选基因测序，认为这是“完全的浪费”。现在，它通常对一个受影响的家庭成员进行外显子组测序，即使怀疑某个已知疾病基因发生了突变。如果结果为阴性，则对第二个受影响家庭成员的外显子组进行测序。
在试点研究中剩下的148个家族中，该团队排除了另外30个，因为全基因组参数连锁分析揭示了它们的单一连锁峰，这表明使用了比外显子组测序更直接的方法来识别突变基因。
然后，他们对118个剩余家族中每一个患者的外显子组进行测序，获得96%的外显子组的平均读取深度超过10倍。测序在Broad研究所进行，使用Agilent SureSelect All Exome 50 Mb试剂盒和Illumina GAIIx或HiSeq 2000，每个外显子组有75个碱基对末端reads和30倍测序深度。
平均而言，研究人员确定了每个患者26000个变异，并根据假设的隐性疾病模型、突变类型、氨基酸保存、预测的蛋白质损伤以及基因与疾病的相关性对这些变异进行筛选和优先级排序。最终名单上的变体(每个家族有4到21个)通过桑格测序进行了验证，并对家族中的分离进行了测试。
在10名患者(占8%)中，研究人员发现了已知会导致神经发育疾病的基因突变，他们之前忽略了这些突变，因为患者的症状不建议对这些基因进行检测。在这10个病例中，这一发现改变了他们最初的诊断，或修改或纠正了它。
格里森说，正确的诊断在某种程度上对所有10个家庭都有帮助，例如，可以更好地了解未来可能出现的问题，或使更好的遗传咨询、携带者检测和产前检测成为可能。在两个病例中，新的诊断还导致了药物的改变。
在22名患者(19%)中，研究人员发现了一个基因中的单一纯合变异，而这个基因之前与疾病没有关联。其中两名患者——一名患有小头畸形、脑回模式简化和胰岛素依赖型糖尿病;另一个患有朱伯特综合症，他们发现他们鉴定的基因GFM2而且EXOC8-是疾病的“合理候选者”。
格里森说，在其他20名患者中，研究人员现在已经发现了其他患者的相同基因突变，这使得他们很可能是致病原因。他说，研究人员现在越来越多地在合作网络中分享他们的结果，这增加了发现具有相同基因突变的不相关家族的几率。
在86名患者(约四分之三)中，研究人员发现了2到10种变异，“其中一些是很好的致病候选者，”他们写道。格里森说，他们现在正在寻求一系列的策略，以减少到单一的致病变体。
最直接的方法是对第二个受影响的家族成员的外显子组进行测序，这可以消除绝大多数变体。“这是我们最有效的策略，”他说，将拥有“非常好的单一候选基因”的家庭比例从20%提高到80%左右。
另一种策略是根据公共数据库(如dbGAP)对数据进行过滤，以进一步消除不致病的变异。
Gleeson说，第三种方法是在家族中寻找突变的分离，这对几个变体是可行的，但对几十个变体不可行。
总的来说，这项研究只改变了8%的病例的诊断，这可能并不被视为一个巨大的成功。但结果是有偏差的，因为该研究只包括了候选基因测序不成功的病例。格里森说:“如果我们把我们在候选基因中发现突变的40个病例包括在内，数字看起来会完全不同。”
此外，对8%患者的正确诊断仍然可以证明外显子组测序是一种诊断工具。格里森说:“如果医学界认为这种结果是值得的，那么我认为它将支持目前临床中的外显子组测序。”
他说，许多医生已经在为他们的病人登记——尤其是那些所有现有检测结果都为阴性的“医学谜题”——参加外显子组测序研究。
数据解释仍然是一个瓶颈，阻碍外显子组测序成为常规的诊断工具。“生成数据并不难，”格里森说。“更难的部分是解读。”例如，即使突变属于已知的疾病基因，也需要谨慎，因为以前报道的许多突变都是假阳性。
“随着时间的推移，我们将看到研究和临床越来越紧密地结合在一起，”格里森说。“这是一个研究将引领临床的实例，就像[拷贝数变异]分析最初是作为一项研究开始的，现在已成为广泛使用的临床诊断工具一样。”
到目前为止，在研究人员研究的一些家庭中，外显子组测序没有发现任何候选变体，对于这些家庭，全基因组测序将是下一步。他说，虽然在未来一段时间内分析内含子和调控元件中的变异将会很困难，但“我认为，随着我们在未来几年更好地了解表观基因组和调控元件，软件将会得到改进。”他补充说，转向全基因组测序的另一个原因是外显子组测序不能揭示拷贝数的变化。
格里森的实验室目前正在将外显子组测序应用于其队列的其余部分，同时完成了对近亲家庭的招募。
目前，该公司还在使用外显子组测序来寻找神经发育疾病患者的体细胞突变。“现在有很大的兴趣新创这种突变不仅发生在卵子或精子中，也发生在合子后，即胚胎开始发育之后，我认为外显子组测序在这方面可以发挥巨大作用。”