来自阿拉巴马大学的研究人员伯明翰大学和华盛顿大学的研究人员已经证明，他们可以调整研究的方式分枝杆菌smegmatisporin A (MspA)蛋白被生产出来——这一步骤有望在纳米孔测序领域带来更精细的蛋白质定制方法。
MspA是一种同源八聚体蛋白，由同一基因编码的八个相同亚基产生。目前，这意味着任何引入基因的突变——例如，试图优化蛋白质的纳米孔测序潜力或为其他应用定制它——最终都在所有8个MspA亚基中结束。
阿拉巴马大学伯明翰分校微生物学研究员Michael Niederweis说:“因为MspA由8个单体组成，当我们突变MspA基因时，每个突变在毛孔中出现8次。按顺序．
他说:“我们想要制造一种只包含一个蛋白质结构域的MspA纳米孔。”
Niederweis解释说，如果有可能从一个大基因中产生所有的MspA蛋白亚基，而不是从一个小基因中产生八个相同的亚基，研究人员将能够更精确地了解他们在MspA基因中产生的突变及其在由此产生的孔中的位置。
例如，理论上，他们可以针对整个蛋白质中只发生一次的突变，或者添加只影响一个或几个组成孔的亚基的突变，这取决于他们所追求的改进类型。
在《公共科学图书馆•综合》今年6月，尼德维斯和他的同事发表了一份原理证明研究这表明应该有可能生产出这样的单链MspA。特别是，研究人员报告说，他们已经朝着这个目标迈出了第一步:用四个亚基二聚体而不是八个独立的亚基生产功能性MspA。在这些蛋白质中，每个二聚体由一对mspA基因编码，它们与中间的连接子序列一起表达。
尼德维斯说:“我们对刚刚公布的结果感到非常鼓舞。”
“我们基本上制造了一个由两个mspA基因组成的基因，”他补充说。“我们将这些mspA基因连接起来，形成二聚体mspA，并与其他三种二聚体组合形成mspA孔。”
由此产生的蛋白质被证明能够在体内形成功能通道m . smegmatis细胞。而且，研究人员报告说，纯化的二聚体衍生的MspA蛋白在他们的脂质双分子层研究中形成了孔隙，并且易位的DNA具有与传统MspA孔隙相似的电流分布。
该研究的作者写道:“这些结果代表了改变MspA亚基组装的关键一步，以增加对MspA通道的化学和生物物理特性的控制，用于DNA测序等纳米技术应用。”
该团队现在计划尝试用更长的基因串来制造MspA，从由四个相连的MspA基因副本编码的四聚体亚基开始。
“下一步将是制造一个由四个而不是两个单独的mspA基因组成的基因。然后我们只需要其中两个四聚体就可以形成MspA孔。”Niederweis说。“最后一步将是创建一个非常长的基因，由8个单独的mspA基因组成，这样由该基因制成的蛋白质就是完整的mspA孔。”
一旦这种结构被创造出来，研究人员就可以对孔隙蛋白进行更有针对性的潜在改进，例如导致每个核苷酸的信号更明显的突变和/或减缓DNA通过孔隙的突变。
后一种特性对于未来提出一种流线型的纳米孔测序设备可能特别重要，因为该团队目前依赖于一种碱基检测策略，该策略使用第二种蛋白质phi29 DNA聚合酶来减缓DNA在孔中的传输。
Niederweis指出，该团队也有兴趣探索改变MspA收缩带大小的后果，看看是否有可能改善蛋白质的自然孔径。
他们目前的亚单位二聚体生产策略类似于概述生物化学杂志文章去年由牛津大学化学家、牛津纳米孔技术公司创始人哈根·贝利和他的同事共同完成。他们表明，有可能从亚基二聚体与单体结合中合成含有7个亚基的α溶血素孔隙蛋白。
该团队一直在开发自己的纳米孔测序系统，该系统基于α溶血素的改良版本(是10/12/2010)，这种蛋白质起源于葡萄球菌细菌。据报道，牛津纳米孔的设备将于今年投放市场(是2/7/2012)。
虽然该小组一直在研究α溶血素，但Niederweis、华盛顿大学生物物理学家Jens Gundlach和他们的同事一直在研究一种围绕MspA构建的纳米孔测序策略，他们的研究表明，这种策略本质上更适合这种应用(是8/24/2012)。
今年早些时候，这项研究的作者与阿拉巴马大学和华盛顿大学的其他研究人员合作进行了一项研究自然生物技术vwin德赢ac米兰合作研究表明，他们可以使用基于MspA突变版本的纳米孔获得单核苷酸分辨率，同时控制DNA通过该孔的运动(是3/27/2012)。
对于目前的研究，研究人员开始了一系列初步实验，涉及使用MspA二聚体和密切相关的蛋白质MspB的二聚体产生的蛋白质。
在证明从这些二聚体中产生蛋白质是可行的之后，该团队将注意力转向了仅由MspA亚基产生的蛋白质，在两个MspA基因之间创造融合，并由连接子序列连接并克隆到表达质粒中。
为了测试由MspA二聚体产生的MspA蛋白的功能，研究人员将它们表达在m . smegmatis缺少野生型基因的细菌。他们报告说，由他们设计的二聚体产生的MspA的存在提高了细胞吸收葡萄糖的能力，这表明孔蛋白具有功能，能够进行适当的折叠和定位。
他们还纯化了得到的MspA蛋白，并表征了一系列性质，如孔隙电导和电压门控。Niederweis说:“我们看到的是，由MspA二聚体制成的MspA具有与野生型MspA非常相似的特性。”
同样，当冈拉克华盛顿大学实验室的合作者测试由二聚体亚基产生的纯化MspA蛋白时，他们发现这些孔可以有效地转移DNA。
同样，尽管存在连接每个二聚体的两个部分的连接区域，但孔隙的性质与野生型MspA非常相似。
Niederweis说:“我们得出的结论是，连接剂不会影响MspA的孔隙性质。”
他解释说:“这很重要，因为我们想使用单链MspA进行纳米孔测序。”“如果这种连接剂对孔隙性质有巨大的影响，这就意味着我们不能使用这种方法进行DNA测序。”
到目前为止，研究人员还没有进行系统的分析，以确定是否有一个最佳的连接子长度，尽管Niederweis说，这可能是未来探索的一个途径，特别是因为它可能会影响MspA的表达水平m . smegmatis．
单链MspA蛋白的表达确实是一个潜在的问题。例如，在目前的研究中，研究人员发现，与野生型蛋白相比，连接蛋白更难产生:它们在基因中的表达m . smegmatis是野生型MspA蛋白的十分之一。
尽管这些表达水平仍然足够高，研究人员可以研究这种蛋白质，但尼德维斯指出，研究小组可能会转向一种替代生物，比如大肠杆菌以表达连接的单体，例如，如果表达越来越长的结构下降太多。
他补充说，在该系统中还有其他考虑因素，其他小组的研究表明，将MspA蛋白重新折叠可能很难大肠杆菌．
Niederwies指出，该团队已经为其MspA生产和其他纳米孔测序技术申请了专利，并致力于生产基于MspA的商业纳米孔测序系统，尽管该设备的时间表仍不确定。
他说:“要使MspA成为这样的设备，我们还有很多工作要做，但当你查看已发表的数据时，MspA是目前为止最适合这种应用的蛋白质，所以我认为实现这一点有很大的商业利益。”
在纳米孔测序方面，Niederweis、Gundlach和他们的合作者正在继续利用Mark Akeson的加州大学圣克鲁斯实验室(是3/29/2011)。
该策略依赖于纳米孔外围的加工phi29 DNA聚合酶，以及与模板DNA结合的阻断低聚物的存在，该低聚物在DNA第一次通过孔时被去除。一旦它离开，聚合酶就开始复制，并且链从另一个方向通过孔(是2/21/2012)。
Niederweis指出:“这是目前最好的方法，但它是一个复杂的设置，因为你有两种蛋白质既需要控制，又需要一起工作。”
因此，随着他们特异性修饰MspA的能力的提高，研究人员希望能够在没有额外phi29成分的情况下，对MspA进行调整，以延迟DNA易位。
但是，Niederweis警告说，是否有可能引入MspA突变，使孔隙本身的特性充分减缓DNA的转运仍有待观察。他还说，第一代MspA纳米孔测序设备可能同时包含phi29聚合酶和MspA蛋白。
他说:“最终，我们希望摆脱DNA聚合酶，只使用孔隙，因为这将是一个更简单的机制，但这是否可行，我们还不知道。”