纽约(基因组网)-英属哥伦比亚大学的一个研究小组开创了一种单细胞测序的新方法，该方法允许在单个细胞水平上分析拷贝数，比其他方法具有更大的覆盖均匀性和更可靠的检测。
这种方法被称为直接文库制备(DLP)，它使用纳升-体积转位反应进行单细胞全基因组文库制备，无需预扩增或分选。
从本质上说，该方法绕过了目前用于研究肿瘤克隆结构或单个细胞组成的两种主要方法:用计算方法预测共发生突变集群的批量测序和使用全基因组预扩增的单细胞方法。
描述的方法在自然方法今天，由UBC的Carl Hansen领导的研究人员用782个细胞测试了这种方法，其中268个来自细胞系，514个来自乳腺肿瘤异种移植。他们表明，与现有的单细胞方法相比，该方法可以实现更大的覆盖均匀性和更可靠的拷贝数变化(CNAs)检测，允许使用批量测序方法无法进行的细胞种群多样性分析，但具有同样高的覆盖深度和均匀性。
汉森和他的合作者说，迄今为止，大多数检查肿瘤克隆结构的研究都是使用了大量测序和信息学方法，以梳理出与不同克隆分支相关的突变模式，或者使用单细胞方法，在创建文库之前需要进行某种扩增步骤。
这两种方法都有重要的缺点。该研究小组报告说，尽管批量方法可以识别主要肿瘤亚克隆，但它们识别小群体的能力受到测序错误率的限制。当肿瘤细胞数较低时，它们的效用也有限，而且在低发病率时，它们难以充分处理亚克隆CNAs。
另一方面，在文库构建之前使用全基因组扩增的单细胞方法存在扩增偏差，这降低了覆盖均匀性并掩盖了CNAs的检测，或导致假单核苷酸变异的聚合酶错误。
Hansen和他的同事们说，已经开发出了改进的方法，如简并寡核苷酸引物PCR (dopo -PCR)，它比其他方法如多重置换扩增(MDA)和多重退火和基于环的扩增循环(MALBAC)，使其更易于接受单细胞CNA推断。
然而，DOP-PCR文库不太适合进行SNV分析，因为它们的覆盖广度饱和了更深层的测序，作者认为。
汉森和他的同事写道，研究人员基本上必须选择是使用基于wga的单细胞方法高保真度测量拷贝数，还是使用批量测序方法可靠地检测snv。一种方法不能同时满足两者。
为了建立一个中间地带，该团队创建了一个流体系统，允许他们直接从单细胞模板DNA构建索引库，使用纳升体积的单细胞DNA直接标记，然后通过PCR循环添加测序适配器和索引条形码。
索引的库可以被池用于低深度的多重测序，这使得单细胞复制数检测和克隆亚群的识别成为可能。
最后，从所有细胞的测序读取都是可合并的，为SNV、杂合性丢失(LOH)和断点推断产生相当于高深度的大块基因组。
汉森在一次采访中说:“这种用于文库生成的化学物质Tn5转座酶并不新奇，但诀窍是让它在单个细胞的DNA上起作用。”
“这种方法有效的原因是，如果你能在非常小的体积内处理细胞，你就进入了细胞内DNA模板的浓度在Tn5反应有效工作的范围内。”
汉森补充说:“与传统反应相比，我们将其缩小了大约1万倍，所以浓度与10,000个细胞在正常反应中的浓度相同。”“这是一项根本性的技术突破，使我们能够采用这种方法在低深度对大量细胞进行测序，从而避免掩盖复制数变化的扩增。”
在他们的研究中，Hansen和他的合著者表明，通过提高覆盖均匀性和增加拷贝数分析的可靠性，他们可以超越dopo - pcr，并识别出细胞群多样性的重要方面——如小的异种移植细胞亚群，这些亚群无法通过批量测序检测到。
当他们创建了自己的大块基因组等价物用于snv的深度分析时，他们发现合并的文库具有与相同测序深度下实际大块基因组相当的覆盖均匀性。
有趣的是，DLP方法还可能允许研究人员使用最初的CNV结果来识别和分离克隆细胞亚群，然后为每一个这些组创建单个的大基因组，用于SNV和其他孤立谱系的更深入分析。
汉森表示，与DLP相关的知识产权已被授权给免疫曲目测序公司AbCellera，他是该公司的总裁兼首席执行官。他和他的同事最初成立了一个单独的公司专门开发和商业化DLP，但最近决定将该技术整合到一个单一的公司。vwin德赢ac米兰合作
尽管AbCellera的活动与DLP的直接相关性较小，Hansen说，该技术在免疫治疗方面可能有应用，例如，在检测癌症克隆或分化方面，使患者对特定的免疫治疗药物产生反应。vwin德赢ac米兰合作然而，该团队目前并没有积极考虑这一点。
然而，他们正在优化该方法，包括改变格式以允许吞吐量的显著扩展。
汉森说:“我不会说我们是如何做到的，但我们正走在一条很好的道路上，每次运行多达数千个细胞。”
在最终应用方面，Hansen说，最直接有前途的领域显然是癌细胞的分析，无论是在大块肿瘤标本中，还是在循环中。
根据作者的说法，DLP的另一个令人兴奋的优势是，当单细胞基因组被合并时，关于每个读取来自哪个细胞的信息被保存了下来。
Hansen说:“未来的计算方法可能会利用这一特性，以更好的能力推断合并DLP基因组中的snv、LOH和断点，并综合表征较低测序深度下拷贝数亚群之间的体细胞基因组变异的差异。”“我们设想，直接制备单细胞文库可能成为异质群体测序的一种新的标准方法。”
他进一步指出，在观察大块肿瘤的相同测序深度和成本下，“你可以得到这两组信息，大块表示和关于细胞谱系相关性的拷贝数信息。”检测cnv的灵敏度也会大幅提高。”
例如，该小组表明，该方法能够在约0.2%的患病率下检测单个CNV。汉森说:“有了大容量，你就能幸运地找到20%流行的东西。”所以对我来说，如果我们能把它标准化就没有理由再做一个大的基因组了。这是在同样的成本下获得更多的信息。”