旧金山(GenomeWeb)——亚硫酸氢盐测序长期以来一直是分析甲基化的金标准，尽管它有一些缺点，比如对输入DNA的要求很高，而且化学处理会破坏DNA。
然而，现在牛津大学路德维希癌症研究所的研究人员开发了一种方法，可以在单碱基分辨率下检测5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，从而绕过了亚硫酸氢盐转化的限制。这部作品于周一出版自然生物技术vwin德赢ac米兰合作研究人员的目标是将其商业化，并使用它来检测循环肿瘤DNA的表观遗传修饰。
芝加哥大学教授、基因组科学卓越中心主任何川(Chuan He)说，他没有参与这项研究，但也参与了开发表观遗传测序方法他说，路德维希团队的方法“有可能诱导更少的DNA降解(比亚硫酸氢盐转化)，并可能成为该领域真正有用的补充”。
该研究的共同高级作者、路德维希癌症研究所助理成员宋春霄表示，他一直对在临床癌症研究中使用表观遗传学感兴趣，特别是在无细胞DNA上的甲基化标记，以帮助癌症诊断和早期发现。
“但是，在我们达到这一点之前，我们需要工具，”他说。“亚硫酸氢盐测序是金标准，非常有用，但一直不令人满意。”
亚硫酸氢盐测序是间接的——通过将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，研究人员必须推断剩余的未甲基化胞嘧啶碱基实际上是甲基化的。此外，宋说，这种转化会导致“不平衡的基因组”。由于绝大多数胞嘧啶碱基没有甲基化，将这些碱基转化为胸腺嘧啶会给下游的测绘和分析带来问题。另一个缺点是化学处理本身很苛刻，最终会降解大部分DNA。为了解决这个问题，研究人员使用大量的输入DNA，但对于有限的样本，如无细胞DNA，这是不可实现的。
亚硫酸氢盐测序的这些局限性促使Song和他的团队想看看他们是否能开发出一种不同的方法。为了做到这一点，他们将一种已知的酶TET与新的化学物质结合起来。
这种被称为tet辅助吡啶硼烷测序(TAPS)的方法还有一个优点，即它不使用刺激性化学物质，因此不会损坏DNA。
研究人员已经为这种方法申请了专利，宋说他们正在探索将其商业化的选择，包括分拆一家公司或将该技术授权给现有的公司进一步开发。vwin德赢ac米兰合作
该方法使用TET，一种天然存在的酶，将5-mC和5-hmC氧化成5-羧基胞嘧啶。包括芝加哥大学的He在内的研究人员此前已经利用TET开发了表观遗传测序方法。例如，他的团队使用TET结合亚硫酸氢盐测序来量化5-hmC。
路德维希小组的方法的新成分是在将5-hmC和5-mC转换为5-caC之后产生的。通过对5-caC的实验和筛选可以与5-caC反应的化学物质，研究人员发现含硼烷的化合物可以与5-caC反应，最终将其还原为尿嘧啶衍生物东华大学。因为东华大学是一种尿嘧啶衍生物，它被DNA和RNA聚合酶识别为胸腺嘧啶。
在此转换后，测序正常进行，之后数据被映射回基因组。而且，“只要有c -t突变，这就表明了5-mC或5-hmC的位置”，Song说。
此外，研究人员还开发了一种方法，可以分离出其中一个甲基化标记。为了做到这一点，他们使用-葡萄糖转移酶标记5-hmC，保护它免受TET氧化和硼烷还原。只有5- mc转化为胸腺嘧啶，5-hmC的位置可以通过减法推导出来。
为了测试TAPS方法，研究人员将其与小鼠胚胎干细胞基因组DNA的全基因组亚硫酸氢盐测序进行了比较。该团队使用100纳克输入DNA用于TAPS方法，200纳克输入DNA用于亚硫酸氢盐测序。他们还使用峰值控制来估计TAPS的假阴性和假阳性率。
TAPS方法的假阴性率在2.7%到3.5%之间，假阳性率为0.23%，研究人员表示，这与亚硫酸氢盐测序相当。他们引用了研究该研究比较了9种商业亚硫酸氢盐测序试剂盒，发现平均假阴性率和假阳性率分别为1.7%和0.6%。
此外，Song指出，TAPS的生物信息学比亚硫酸氢盐测序简单得多。宋说，亚硫酸氢盐测序需要将数据映射到不同的基因组上，“因此需要大量的计算资源。”相比之下，TAPS方法可以使用标准的突变检测信息学。它比亚硫酸氢盐测序的分析速度快三倍，而且宋指出它更便宜。他说:“我们在两种方法上花了同样多的钱，但与亚硫酸氢盐测序相比，TAPS获得了两倍的有用数据。”
Song指出，该团队现在计划将该方法用于无细胞DNA。宋说，研究人员已经证明了这一应用的原理，第一项研究正在进行中。
此外，Song说，由于TAPS不会破坏DNA，它也可以与太平洋生物科学公司和牛津纳米孔技术公司等长读测序技术结合起来。vwin德赢ac米兰合作他说，该团队目前正在牛津纳米孔公司的MinIon上测试该方法，并正在与其他研究小组合作，在PacBio公司的Sequel仪器上进行测试。
研究人员还开发了在PacBio公司和牛津纳米孔公司的仪器上直接检测表观遗传标记的方法。在PacBio仪器上，表观遗传修饰可以通过测量聚合酶动力学的变化来检测-当聚合酶在结合核苷酸时遇到DNA修饰时，有一个可测量的暂停。表观遗传修饰可以在MinIon上检测，使用生物信息学检测由修饰的碱基通过孔迁移引起的电流差异，如a中所述自然方法研究2017年出版。
Song说，TAPS的一个潜在优势，至少与PacBio测序相结合，是与基于聚合酶动力学的方法相比，它不需要深度覆盖测序。
他补充说，用长读测序检测甲基化将有助于理解甲基化在基因组区域中的作用，这些区域很难用短读测序，如重复区域和着丝粒。
最后，该团队还对进一步开发TAPS以使其在单细胞水平上有用感兴趣。
Song说，他的实验室计划专注于将TAPS用于肿瘤学应用，特别是检测无细胞DNA的甲基化，并对将其开发用于单细胞测序应用也感兴趣。然而，他指出TAPS可以有更广泛的用途，可以在传统上使用亚硫酸氢盐测序的地方使用，甚至“有可能在常规使用中取代亚硫酸氢盐测序”。